SSCP
S-SAP
AFLP
SNP
SAMPL
شکل۲-۱ انواع نشانگر(نقوی و قره‌ریاضی،۱۳۸۸)
۲-۲-۹ نشانگرهای ریخت‌شناسی^[۱۵]
نشانگرهای ریخت‌شناسی اولین نشانگرهایی بودند که برای ارزیابی تنوع ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفتند این نشانگرها در واقع نتیجه جهش‌های قابل رویت در ریخت ظاهری موجود هستند. ودر صورتی می‌توانند به عنوان نشانگر ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرند که بیان آنها در طیف وسیعی از محیط‌های مختلف تکرارپذیر باشد. اگه چه تنوع ریخت‌شانسی به راحتی قابل مشاهده بوده و کمک زیادی به تحقیقات پایه‌ای می‌کند، ولی به دلیل کم بودن تعداد آنها، وابسته بودن آنها به سن و مرحله رشدی گیاه و وابسته بودن آنها به محیط، استفاده از آنها با محدودیت زیادی همراه است. همچنین عواملی نظیر اثرات غالبیت، اپیستازی و پلیوتروپی بروز این تنوع را تحت تاثیر قرار می‌دهند و استفاده از آن را مشکل می‌سازد. به همین خاطر دستیابی به نشانگرهای کاراتر توجه بیشتر محققین را به خود جلب کرده است(نقوی و قره‌ریاضی،۱۳۸۸). امروزه به خوبی مشخص شده است که استفاده از نشانگرهای تکمیلی مانند نشانگرهای مولکولی و سیتوژنتیکی در کنار نشانگرهای ریخت‌شناسی ارزیابی بسیار جامع‌تر و دقیق‌تری از تنوع گیاهی را به دست می‌دهد(کومار و هیروچیکا، ۲۰۰۱).

۲-۲-۹ نشانگرهای مولکولی
نشانگرهای مولکولی از ابزارهای بسیار مهمی برای مدیریت نمونه‌های ژرم‌پلاسم در بانک ژن، ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیکی، انتخاب گیاهان برتر و بررسی شباهت یا تفاوت بین نمونه‌های مختلف می‌باشد، که برای دستیابی به این اهداف از نشانگرهای مولکولی متعددی استفاده می‌شود(پورساربانی و همکاران، ۱۳۸۴). نشانگرهای مولکولی دارای مزایای متعددی است. این مزایا شامل، صرفه جویی در زمان، استفاده از فضایی آزمایشگاه و قابلیت اطمینان بیشتر به نتایج حاصله می‌باشد(چوکان و واربورتون^[۱۶]، ۲۰۰۶). استفاده از اطلاعات مولکولی در مقایسه با خصوصیات مورفولوژیکی برای بررسی روابط فلیوژنی، از چندین مزیت برخوردار است. به عنوان مثال الف) هیچ گونه ارزیابی شخص در تعیین وضعیت صفات دخیل نیست. ب) به دلیل اینکه ساختمان DNA در تمام موجودات زنده از چهار باز نوکلئوتید تشکیل شده است. بنابراین امکان مطالعه مستقیم متنوع‌ترین اشکال حیات وجود دارد. ج) میزان اطلاعات حاصله بسیار زیاده بوده و بدست آوردن این اطلاعات برای گونه‌های مورد نظر در آزمایشگاه، نسبتا ساده است(کومار و هیروچیکا، ۲۰۰۱). نشانگرهای مولکولی به طور فزاینده در تجزیه و تحلیل ژنتیکی گیاه استفاده می‌شود، با توجه به مزایای آشکار خود بر نشانگرهای مورفولوژیک به عنوان مثال چتدشکلی بالا، تعداد باند بیشتر، با ثبات بودن در سرتاسر مراحل رشد گیاه، و حداقل تأثیر محیط بر آنها به عنوان فاکتور موثر برای بررسی تنوع ژنتیکی استفاده می‌شوند(ویجاتان،^[۱۷] ۲۰۰۵). این نشانگرها مبتنی بر PCR بوده و تنها به مقادیر کمی DNA نیاز دارند و سنجش آنها نسبتا سریع است. تکنیک‌های مولکولی امکان بررسی ژنتیکی دقیق و بررسی عوامل محیطی تنوع را امکان پذیر می‌سازد و سبب دقت بیشتر در اندازه‌گیری و ارزیابی تنوع ژنتیکی می‌گردد(رضوی‌زاده و احسان‌پور، ۱۳۹۱). علاوه بر این قدرت تبعیض عالی در میان ژنوتیپ‌های مشابه و توانایی گروه‌بندی، گروه‌های هتروتیک^[۱۸] بر اساس فاصله ژنتیکی دلیلی دیگر برای استفاده از نشانگرهای مولکولی می‌باشد علاوه بر این تکنولوژی نشانگر مولکولی نقش حیاتی در زیست شناسی گیاهی، از جمله انگشت نگاری DNA، نقشه برداری ژنتیکی، روابط فیلوژنتیک و اصلاح مولکولی دارد( بایر^[۱۹]، ۲۰۰۵ و چوکان و واربورتون، ۲۰۰۶). نشانگرهای مولکولی را به دو دسته نشانگرهای پروتئینی و نشانگرهای حاصل از DNA تقسم‌بندی می‌کنند(عبدمیشانی و شاه‌نجات بوشهری،۱۳۸۶).
۲-۹-۲-۱ نشانگرهای پروتئینی
مطالعه اولیه مولکولی با اهدف طبقه‌بندی با بهره گرفتن از نشانگرهای پروتئینی انجام می‌شد. نشانگرهای پروتئینی فرآورده نهایی ژن‌های ساختاری بوده که در واقع بیانگر تنوع موجود در سطح توالی نوکلئوتیدی ژنوم هستند اما از آنجا که محصولات ژن از روی قسمتی از توالی‌های DNA ساخته می‌شوند در برگیرنده همه تغییرات موجود در سطح DNA نیستند و نمی‌توانند نمایند کل‌ ژنوم باشد. یکی از نشانگرهای پروتئینی معمول نشانگرهای آیزوزایمی هستند که چندین دهه است از ‌آنها استفاده می‌شود. آیزوزایم‌های شکل‌های مختلف یک آنزیم‌اند که اغلب تحریک الکتروفورزی متفاوتی دارند که با بسترهای نشاسته‌ای یا پلی‌اکریلامیدی از یکدیگر جدا می‌شوند(چاولا^[۲۰]، ۲۰۰۲).
۲-۹-۲-۲ نشانگرهای مولکولیDNA
تاکنون انواع مختلف نشانگرهای DNA با تفاوت‌های زیاد از نظر تکنیکی و روش تولید، نحوه کابرد، امیتازبندی، تجزیه و تحلیل و تفسیر نتایج به سرعت ابداع و معرفی گردیده‌اند. بدون ترید ابداع و معرفی واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز یا PCR، بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است(گوپتا و همکاران ۱۹۹۹). نشانگرهای مولکولی DNA را در سه گروه، مبتنی بر دورگ‌گیری، مبتی بر PCR و مبتنی بر توالی‌یابی تقسیم‌بندی کرده‌اند. تکنولوژی‌های متعدد نشانگری مبتنی بر DNA برای شناسایی چندشکلی‌ها و سنجش زیر مجموعه‌ای از مقدار کل DNA ژنومی توسعه یافته است(کومار و هیروچیا، ۲۰۰۱).
۲-۹-۲-۲-۱ نشانگرهای DNA مبتنی بر دورگ‌گیری
در این گروه انگشت‌نگاری الیگونوکئوتیدی،RFLP، RLGS، VNTRS، Minisatellite قرار می‌گیرد.
۲-۹-۲-۲-۲ نشانگرهای مبتنی بر توالی‌یابی
در این گروه نشانگرهایی مانندEST و SNPقرار می‌گیرد.
۲-۹-۲-۲-۳ نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز از زمان شروع، در بسیاری از روش‌های استاندار زیست‌شناسی مولکولی و بیوتکنولوژی انقلاب ایجاد کرده و باعث تولید نشانگرهای مختلفی شده، این نشانگرها که مبتنی بر واکنشPCR^[21] هستند، شامل:ISSR^[22] ، RAPD^[23]، SSR^[24]، ,SNP^[25]،AFLP^[26]، ^[۲۷]RFLP و غیره می‌باشند(بایر و همکاران۲۰۰۵، چوکان و واربرتون، ۲۰۰۶ و نقوی و قره‌ریاضی، ۱۳۸۸).
از نظر کاربردی نشانگرهای بارز برای استفاده در مطالعات تنوع‌ژنتیکی، همسانه‌سازی مکانی و اشباع سریع نقشه‌های ژنتیکی مناسب‌اند و در مقابل، نشانگرهای هم‌بارز جهت تهیه و افزایش دقت نقشه‌های عمومی برای یک گونه، نقشه‌یابی مقایسه‌ای بین گونه‌ها، نقشه‌یابی جایگاه‌های صفات کمی(QTLS)، تهیه نقشه‌های ژنی و مطالعه ژنتیک جمعیت کاربرد بیشتری دارند(وین^[۲۸]،۲۰۰۳). هر کدام از انواع نشانگر‌هایDNA مجموعه‌ای از مزایا و معایب را در وراثت، تکرارپذیری، میزان اطلاعات بدست‌ آمده، میزان پیچیدگی روش و همچنین جنبه‌های اقتصادی از قبیل هزینه و زمان مورد نیاز تا حصول نتیجه‌ نهایی را دارا هستند(روکاسزی و بولیبوک^[۲۹]، ۲۰۰۴). از آن رو لازم است که قبل از کاربرد هر کدام سودمندی و کارایی نشانگر سنجیده و ارزیابی شود(کومار و هیروچیکا، ۲۰۰۱). یک نشانگر مناسب بایستی قابل دسترس بوده و تفسیر نتایج آسانی داشته، از تکرارپذیری بالایی برخوردار بوده و به فراوانی مناسب در ژنوم باشد(وین، ۲۰۰۳).
نشانگر RAPD: در این روش از یک آغازگر به طول تقریبی ۱۰ نوکلئوتید برای مطالعات ژنتیکی استفاده می‌شود. این روش معمولا برای برآورد تنوع ژنتیکی بین اعضاء جمعیت‌ها یا گونه‌های بسیار نزدیک به هم استفاده می‌شود. چندشکلی در RAPD بر این اصل استوار است که اگر جایگاه اتصال و هیبرید شدن یک آغازگر در یک ژنوم، حتی یک نوکلئوتید تفاوت داشته یاشد، این تغییر می‌تواند منجر به حذف یک باند و ایجاد چندشکلی شود باندهای بدست آمده به عنوان صفات مستقل و البته با ارزش یکسان در نظر گرفته می‌شود. چندشکلی باندها را می‌توان در قالب سیستم جفتی نمره‌دهی کرد. تکرارپذیر بودن یا نبودن نکته مهم استفاده از این روش است ولی با این وجود RAPD به طور گسترده برای تفکیک گونه‌های نزدیک به هم استفاده شده است(ویلیلمز و همکاران، ۱۹۹۰).
نشانگر:AFLP این تکنیک یکی از محبوب‌ترین و سودمندترین روش‌های انگشت‌نگاری ژنتیکی است. AFLP نیز یک روش تکثیر تصادفی می‌باشد. و نیازی به داشتن اطلاعات از توالی موجود مورد بررسی ندارد. AFLP تعداد باندهای بیشتری نسبت به RAPD تولید می‌کند. این روش شیوه‌ای مطمئن و قوی می‌باشد که چندان تحت تاثیرمتغیرهای موجود در واکنش PCR قرار ندارد اما در عین حال روشی پرهزینه است. تکنیک AFLP باعث پیشترفت زیادی در انگشت‌نگاری DNA شده است(فارسی و ذوالعلی، ۱۳۸۴).
نشانگرRFLP: اولین نشانگری که چندشکلی در سطح توالی‌های DNA را مشخص کرده نشانگر RFLP بود. در این هضم مولکول DNA با یک آنزیم برشی خاص منجر به تولید قطعاتی با طول معین و متفاوت خواهد شد. جهش نقطه‌ای درون یم مکان آنزیم برشی منجر به تغییر الگوی برش و تفاوت در طول قطعات و تعداد آنها خواهد شد. بنابراین یک چندشکلی قابل تظاهر بین ژنوتیپ‌های مختلف ایجاد خواهد شد(باقری و همکاران، ۱۳۹۱).
نشانگرهای ریزماهواره‌ها: ریزماهواره‌ها (SSRS)، توالی‌های ساده تکراری هستند که در ژنوم تمام یوکاریوت‌ها یافت می‌شود و از ۶-۱ توالی نوکلئوتیدی مثل AAG که به صورت پشت سرهم چندبار تکرار می‌شود، تشکیل شده‌اند. و ریزماهواره‌ها هم در نواحی کدکننده و هم نواحی غیر کدکننده وجود دارند. و با ایجاد چندشکلی در طول قطعات قابل شناسایی هستند. با وجود اینکه مکانیسم تکامل ریزماهواره‌ها هنوز به درستی مشخص نیست، اما به صورت گسترده به عنوان نشانگری قوی در ژنتیک جمعیت استفاده می‌شود(رضوی‌زاده و احسان‌پور،۱۳۹۱ و نقوی و قره‌ریاضی، ۱۳۸۸).
۲-۱۰ تخمین فاصله ژنتیکی
آگاهی از میزان تنوع ذخایر توارثی بین افراد یکی از اهداف ارزشمند اصلاح گونه‌های گیاهی است. تاکنون چندین راهکار برای تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی در ارقام، لاین‌های اصلاحی و جمعیت‌ها مورد استفاده قرار گرفته‌اند. فاصله ژنتیکی یعنی تفاوت بین موجودات که می‌تواند به صورت اختلاف فنوتیپی یا آللی توضیح داده شود. تعریف جامع دیگری از فاصله ژنتیکی عبارتند از: هر نوع تفاوت ژنتیکی قابل اندازه‌گیری در سطح توالی ژن‌ها یا فراوانی‌ها آللی که بین اعضاء، جمعییت‌ها یا گونه‌ها قابل تشخیص باشد(پراسانا و محمدی^[۳۰]، ۲۰۰۳).
برای درک فاصله ژنتیکی می‌توان به صورت مجازی آن را به سه دسته فاصله ژنتیکی مطلق^[۳۱]، فاصله ژنتیکی نسبی^[۳۲]و فاصله ژنتیکی عملکردی^[۳۳] تقسیم کرد. فاصله ژنتیکی مطلق بر مبنای مقایسه تفاوت‌ها و شباهت‌های ژنومی بین دو فرد است که به صورت مکان ژنی صورت می‌گیرد و می‌تواند بازتاب کاملی از رابطه بین افراد باشد. در عوض فاصله ژنتیکی نسبی رابطه را بر مبنای داده‌های استفاده شده برای محاسبه فاصله در اختیار می‌گذارد. فاصله ژنتیکی عملکردی به صورت اثر تجمعی نشانگرهای مولکولی ژنومی که نقشه آن تهیه شده برای یک مقدار معنی‌دار از تفاوت‌های مشاهده شده برای یک صفت تعریف می‌شود. در عمل فقط فواصل ژنتیکی نسبی را می‌توان اندازه گیری کرد. در مجموع چندین عامل، تخمین روابط ژنتیکی بین اعضاء را تحت تاثیر قرار می‌دهد که عبارتنداز تعداد نشانگر مورد استفاده، توزیع نشانگرها در سطح ژنوم و طبیعت مکانیزم‌های تکاملی که در واقع زیربنای تنوع محاسبه شده است(پاول^[۳۴]و همکاران، ۱۹۹۶).
۲-۱۱ روش‌های آماری تجزیه تحلیل تنوع ژنتیکی
به منظور مطالعه تنوع، عموما از ضریب تغییرات فنوتیپی^[۳۵](PCV) و تغییرات ژنتیکی^[۳۶](GCV) استفاده می‌شود. مطالعه تنوع ژنتیکی فرایندی است که تفاوت بین افراد، جمعیت‌ها و یا گروه‌ها را با بهره گرفتن از روش‌های آماری خاص براساس داده‌های حاصل از ارزیابی صفات مختلف بررسی می‌شود. تنوع ژنتیکی می‌تواند براساس صفات مورفولوژیک(کیفی و کمی)، شجره افراد و یا خصوصیات مولکولی افراد بیان شود(پاول و همکاران، ۱۹۹۶ و لامکی و لی^[۳۷]،۱۹۹۳). با افزایش اندازه نمونه، تعیین شباهت‌ها و تفاوت‌های بین افراد مشکل‌تر می‌شود. یکی از بهترین راهکارهای طبقه‌بندی ذخایر توارثی و تجزیه تحلیل چند متغیره از تجزیه هم‌زمان چندین متغیر برای بررسی روابط بین افراد استفاده می‌شود. این تکنیک‌ها امروزه به طور گسترده‌ای برای تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی داده‌های مختلف از قبیل داده‌های مورفولوژیکی، بیوشمیایی یا نشانگرهای مولکولی برای بررسی روابط افراد مورد استفاده قرار می‌گیرد. از بین این الگوریتم‌ها تجزیه خوشه‌ای^[۳۸]و تجزیه به مولفه‌های اصلی^[۳۹]‌(PCA) بیشتر از بقیه کاربرد دارند(کالدرینی^[۴۰] و همکاران، ۱۹۹۷).
۲-۱۲ تجزیه خوشه‌ای
تجزیه خوشه‌ای به گروهی از روش‌های چند متغیره که هدف اولیه آنها گروه‌بندی افراد می‌باشد اطلاق می‌گردد. از طریق این روش اعضاء مشابه از نظر صفات مورد بررسی در یک خوشه واحد کنار هم قرار می‌گیرند. در نتیجه این دسته‌بندی اعضاءی که در یک خوشه قرار می‌گیرند دارای شباهت زیاد و اعضاءی که در خوشه‌های جداگانه قرار می‌گیرند تفاوت‌های زیادی با هم دارند. بنابراین اگر طبقه‌بندی بصورت صحیحی انجام گیرد اعضاءی که در یک خوشه قرار دارند در نمایش هندسی در کنار هم قرار گرفته و اعضاءی که در خوشه‌های جداگانه قرار دارند از یکدیگر دورتر هستند .در بین روش‌های تجزیه خوشه‌ای بیشتر الگوریتم‌های مبتنی بر فاصله در تجزیه تنوع ژنتیکی استفاده می‌شود. در روش‌های مبتنی بر فاصله، ماتریس فاصله به عنوان ورودی مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرد و خروجی آن به صورت گرافیک( درختی یا دندروگرام ) قابل ارائه است(دویلن و گلدستین^[۴۱]، ۱۹۸۴).
روش‌های مبتنی بر فاصله به دو گروه تقسیم می‌شوند که عبارتنداز: سلسله مراتبی^[۴۲]و غیر مراتبی^[۴۳]. روش‌های سلسله مراتبی به دو قسمت تقسیم می‌شود که این روش کاربرد بیشتری در تجزیه تحلیل تنوع ژنتیکی گونه‌های گیاهی دارد. در روش سلسله مراتبی ترکیبی^[۴۴]، ابتدا هر عضو به عنوان یک خوشه در نظر گرفته می‌شود. بنابراین در فاصله ژنتیکی صفر تعداد خوشه‌ها با تعداد اعضاء برابر است. سپس اعضاء یا گروه‌هایی که بیشترین شباهت را با یکدیگر دارند با هم ادغام شده و در یک خوشه فرار می‌گیرند. لذا ترکیب گروه‌ها بر اساس میزان تشابهات صورت می‌گیرد و در نهایت تمام ژنوتیپ‌ها به یک خوشه منتسب می‌گردد(وارد،^[۴۵] ۱۹۹۷). در روش سلسه مراتب تقسیمی^[۴۶]، ابتدا تمام اعضاء در یک گروه قرار می گیرند. سپس اعضاء درون گروه برا اساس شباهت به زیر گروه‌های متفاوت تقسیم می‌شوند و همین تقسیم‌بندی ادامه می‌یابد تا به عضو برسد. در بین تمام روش‌های سلسله مراتب ترکیبی روش UPGMA^[47]و روش واریانس حداقل وارد^[۴۸] بیشترین کاربرد را برای تجزیه خوشه‌ای دارند. سایر روش‌ها نیز مانند نزدیک‌ترین همسایه^[۴۹]و دورترین همسایه^[۵۰]توسط برخی از محققین برای تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی به کار برده می‌شوند. در مرحله بعد شباهت یا فاصله هر عضو یا اعضاء درون یک خوشه به صورت میانگین فاصله یا شباهت آن عضو از اعضاء خوشه در نظر گرفته می‌شود(پارسانا و محمدی، ۲۰۰۳).
۲-۱۳ تجزیه به مختصات اصلی^[۵۱]
تجزیه به مولفه‌های اصلی نیز یکی دیگر از روش‌های چند متغیره است که دارای کاربرد زیادی است. این روش را می‌توان برای نمایش دوبعدی پراکنش اعضاء بکار برد. تجمع اعضاء در یک ناحیه از پلات نشان دهنده تشابه ژنتیکی آنها می‌باشد. تجزیه به مختصات اصلی به عنوان روشی برای کاستن حجم داده‌ها به منظور روشن ساختن روابط بین دو یا چند متغیر و توجیه تغییرات کل داده‌های اصلی و اولیه بوسیله تعداد محدودی از متغیرهای جدید مستقل به نام مختصات اصلی است. این نوع دسته‌بندی اجازه نمایان شدن تفاوت بین اعضاء را داده و امکان مشاهده همه گروه‌ها را میسر می‌کند. کاسته شدن از حجم داده‌ها بوسیله تبدیل خطی داده‌های اصلی به متغیرهای مستقل جدیدی که به عنوان مختصات اصلی شناخته می‌شودند انجام می‌گیرد. به طوری که اولین مولفه بیشترین مقدار تغییرات داده‌های اولیه را توجیه می‌کند و مولفه دوم بیشترین مقدار تغییرات باقیمانده را بعد از مولفه اول توجیه می‌کند و الی آخر. لازم به ذکر است که هر مولفه تغییراتی را توجیه می‌کند که توسط مولفه‌های قبلی بیان نشده باشد(پارسانا و محمدی، ۲۰۰۳).
۲-۱۴ نشانگرهای ISSR
از بین روش‌های مختلف مبتنی بر PCR نشانگر ISSR یکی از ساده‌ترین آنها می‌‌باشد که به طور گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرد. نشانگرهای ISSR توالی بین تکراری ساده، تکرارهای دو، سه، چهار یا پنج نوکلئوتیدی مبتنی ‏بر PCR می‏باشند، و اولین بار در سال ۱۹۹۴ میلادی توسط زیتکی ویز مطرح شد. و طول آغازگرها ۲۵-۱۶ نوکلئوتید می‌باشد. در این روش، SSRs بعنوان پرایمرهایی برای تکثیر بیشتر مناطق میان SSR استفاده می‌شوند. SSRs یا میکروستلایت‌ها تکرارهای پشت سرهم کوتاه(STRs) یا تعداد متنوعی از تکرارهای پشت سرهم (VNTRs)، یک یا چهار باز حاضر در تمام مناطق ژنوم‌های یوکاریوتی هستند. آنها در سراسر ژنوم گسترده شده و از نظر تعداد واحدهای تکراری متفاوت هستند(زیتکی‌ویز و روفالسکی، ۱۹۹۴ و ردی^[۵۲] و همکاران، ۲۰۰۲). این نشانگر برخی مزایای نشانگر‏های SSR و AFLP را دارا بوده و فاقد معایبی همچون تکرارپذیری کمRAPD ، هزینه بالای AFLP و نیاز به شناخت توالی‌های پیرامونی برای توسعه پرایمرهای اختصاصی گونه‌ها برای نشانگرSSR می‏باشد(ردی و همکاران، ۲۰۰۲ و بورنت و برانچارد^[۵۳]، ۲۰۰۱). روش ISSR نسبت بهRAPD قابل اعتمادتر است و آغازگرهای آن پلی‌مرفیسم بیشتری تولید می‌کند، چرا را که نواحی متغیر در ژنوم را مورد هدف قرار می‌دهد(هانتولا^[۵۴]، ۱۹۹۶). ISSRs عمدتا به عنوان نشانگرهای غالب، تابع توارث‌پذیری ساده مندلی شناخته می‌شوند. اما، آنها همچنین در برخی موارد به‌ عنوان نشانگرهای هم‌بارز شناخته شده‌اند(وجود لنگر طولانی در ׳۵ انتهایی باعث می‌شود که این نشانگر به صورت هم‌بارز عمل کند) چرا که قادر به تمایز میان هموزیگوت‌ها و هتروزیگوت‌ها بوده‌اند. از نشانگر ISSR به شدت در مطالعات تنوع ژنتیکی، نژادهای جانوری یا گیاهی، برچسب‌گذاری ژن، نقشه‌برداری ژنوم و زیست‌شناسی تکاملی استفاده می‌شود(ردی و همکاران، ۲۰۰۲ و مگرگورو همکاران^[۵۵]، ۲۰۰۰). تکرارپذیری بالای ISSRs احتمالا به سبب استفاده از پرایمرهای طولانی‌تر (۱۶–۲۵ mers)در مقایسه با پرایمرهای کوتاهتر رپید (۱۰ mers) می‌باشد که این امر امکان استفاده از دمای بالای اتصال( ۴۵ الی ۶۰ درجه سانتیگراد) را فراهم می‌کند که منجر به افزایش احتمال اتصال پرایمر به نقاط مشخصی از DNA (تکرارپذیری بیشتر) می‌شود و در نتیجه این نشانگر به دلیل فراوانی مناطق تکرار شونده در ژنوم، چندشکلی بیشتری را نسبت به نشانگرهای RAPD نشان داده و باندهای حاصل اطلاعات بیشتری را از ژنوم می‌دهد(اسلامن و همکاران، ۱۹۹۹، امینی و همکاران، ۱۳۹۱). از این نشانگر برای انگشت‌نگاری ژن بدون اینکه نیاز به دانستن توالی ژن باشد استفاده می‌شود(حسن‌نژاد و همکاران، ۱۳۸۴ و ویجتان و ۲۰۰۵). همچنین اگر این نشانگرها باRFLP وRAPD استفاده شوند در تجزیه تحلیل؛ سطح جندشکلی بالاتری را نشان می‌دهد(حسن‌نژاد و همکاران، ۱۳۸۴). از این نشانگر برای شناسایی ارقام سیب ژمینی(بورنت و برانچارد، ۲۰۰۱) ، تهیه نقشه ژنتیکی گیاهان، انگشت‌نگاری ژن، تجزیه و تحلیل روابط فلیوژنتیک، تجزیه و تحلیل ساختار جمعیت، شناسایی واریته و لاین، نقشه‌برداری ژنتیکی، انتخاب به کمک نشانگر^[۵۶] و غیره استفاده شده(ویجتان، ۲۰۰۵).
۲-۱۴-۱ نحوه عمل نشانگر ISSR
در این نشانگر‏ها از تکرار‏های دو و سه‏تایی، استفاده شده که در یکی از انتها‏ها با یک یا چند نوکلئوتید قلاب (لنگر) شد‏ه‏اند، و به ‏عنوان نشانگر‏های تکی PCR استفاده می‏شود. ناحیه قلاب ‏شده (انتهایʹ۳ یا انتهایʹ۵) نشانگر، اجازه اتصال محکم‏تر نشانگر به جایگاه هدف در نمونه الگو را فراهم می‌کند. بنابراین احتمال سر‏خوردن نشانگر بسیار کم خواهد شد. ‏استفاده از نشانگر‏هایSSR قلاب‏شده در انتهایʹ۳ و ʹ۵ به ‏منظور تکثیر DNA بین‏ دو SSR استفاده می‌شود. در حقیقت فقط آغازگرهای قلاب شده در انتهای ʹ۵ قادر به شناسایی تنوع آللی در داخل SSR هدف هستند. آغازگرهای قلاب شده در انتهای׳۵ در مرز بالادست SSR هدف قرار می‌گیرند و به سمت پایین دست حرکت می‌کنند. بنابراین محصولات به دست آمده از آغازگرهای قلاب شده در انتهای׳۵ چندشکلی‌های بیشتری را نشان خواهند داد. توسعه چندشکلی همچنین بنابر طبیعت پرایمر(پرایمر آزاد و یا پرایمر متصل به نوکلئوتید در انتهای ʹ۳ و یا ׳۵) و توالی تکرارها در پرایمر مورد استفاده تغییر می‌کند. وقتی پرایمرهای غیرمتصل، بعبارت دیگر تنها SSRs، بعنوان پرایمر مورد استفاده قرار می‌گیرند، پرایمر تمایل به لغزش در درون واحدهای تکراری در طی تکثیر دارد که منجر به تولید اسمیر، بجای باندهای شفاف، می‌شود. اتصال یک تا چهار نوکلئوتید به انتهای ʹ۳ و یا ׳۵ پرایمر (پرایمر متصل به نوکلئوتید)، این اطمینان را می‌دهد که پرایمر فقط با انتهاهای ریزماهواره در DNA الگو اتصال می‌یابد و بنابراین از پرایمینگ درونی و تشکیل اسمیر ممانعت می‌شود. همچنین، اتصال نوکلئوتید سبب می‌شود که تنها یک زیر مجموعه از میکروستلایت‌ها، بعنوان محل‌های پرایمینگ مورد استفاده قرار بگیرند. وقتی پرایمرهای متصل به نوکلئوتید در انتهای ׳۵ استفاده می‌شوند، محصولات تکثیر شده شامل توالی‌های ریز ماهواره و انواع طولی آنها در طول یک ژنوم هستند بنابراین تعداد بیشتری باند و درجه بالاتری از چندشکلی را ارائه می‌کنند. معمولا پرایمرهای با تکرارهای دو نوکلئوتیدی و متصل به نوکلئوتید در انتهایʹ۳ و یا ׳۵، چندشکلی بالایی را نشان می‌دهند(بلایر و همکاران، ۱۹۹۹ و جویشی و همکاران، ۲۰۰۰). پرایمرهای متصل به نوکلئوتید در انتهای ʹ۳، الگوی بانددهی واضح‌تری را در مقایسه با پرایمرهای متصل به نوکلئوتید در انتهای ׳۵ نشان می‌دهند. از آنجا که پرایمر یک موتیف SSR است تناوب و توزیع موتیف‌های ریزماهواره، موتیف‌ها را در گونه‌های مختلف تکرار می‌کند، همچنین بر تولید باندها تاثیر می‌گذارد. میان توالی‌های DNA اندامک‌ها و هسته از نظر فراوانی SSRs تفاوت وجود دارد تنها محدودیتی که این روش دارد این است که چند شکلی فقط مربوط به جایگاه‌های ژنی SSRهای است که با فاصله مناسب در دو جهت معکوس قرار گرفته باشد. استفاده از این نشانگر بسیار سریع و آسان است و به نظر می‌رسد که به دلیل طویل بودن نشانگر‌ها؛ قابلیت تکثیر نشانگر SSR را نیز داشته باشد(امینی و همکاران، ۱۳۹۱، ردی و همکاران، ۲۰۰۲ و زیتکی‌ویز و رافالسکی، ۱۹۹۴).
شکل ۲-۲ISSR-PCR ، نمایش اتصال پرایمر(AG)8 به DNA الف)غیر قلاب شده ب) قلاب شده در انتهایʹ۳ ج) قلاب شده در انتهای ׳۵٫ هدف در DNA الگو تکثیر بین دو SSR با تکرار(TC)n است. الف) پرایمر(AG)n غیر قلاب شده که به هر ناحیه تکرار(TC)n بر روی DNA الگو قرار گیرد سر می خورد و سرانجام تولید باند اسمیر می‌کند ب) پرایمر AG)n) قلاب شده با دو باز NN در انتهای ʹ۳، که به نواحی ویژه‌ای بر روی DNA الگو متصل می شود و تولید باندهای واضحی می‌کند ج) پرایمرAG)n) قلاب شده با دو باز NN در انتهای ׳۵ که به نواحی ویژه ای بر روی DNA الگو متصل می شود و تولید باندهای واضحی می‌کند( ردی و همکاران۱۹۹۴).
این روش یک روش سریع، کارامد، ساده، کم هزینه، قابلیت خودکار شدن و قابل تکرار است که اکثر فواید و مزایای SSRS و AFLP را با عمومیت RAPD در بر دارد(جدول۲-۳). این روش نیازی به استفاده از مواد رادیواکتیو و خطرناک ندارد. آغازگرها نیز اختصاصی نبوده و می‌تواند به راحتی طراحی و ساخته شوند(گوپتا و همکاران، ۱۹۹۹ و وانگ^[۵۷] و همکاران، ۱۹۹۷).
جدول ۲-۳ مقایسه نشانگرهای مولکولی استفاده شده در اصلاح گیاهان