۱۷

H₂O

جدول ۳-۲- سیکل دمایی PCR با آغازگرهای B1-B2 برای تشخیصPss

Initial Denaturation

۹۴ ^oc

۱۰ min

Denaturation

۹۴ ^oc

۱.۵ min

۳۵ cycle

Annealing

۶۰ ^oc

۱.۵ min

Extension

۷۲ ^oc

۳ min

Final Extension

۷۲ ^oc

۱۰ min

۳-۱-۷-۲- الکتروفورز محصول واکنش PCR
به منظور الکتروفورز محصول واکنش PCR و بررسی قطعه تکثیر شده مورد نظر در آزمون PCR تشخیصی، ژل آگارز ۱ درصد به شرح زیر تهیه شد:

• مقدار ۱ گرم آگارز در ۱۰۰ میلی لیتر بافر TBE ×۱ (۸/۱۰ گرم تریس، ۵/۵ گرم اسید بوریک، و ۷۳/۰ گرم EDTA در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر با ۳/۸PH=)، حل و چند دقیقه جوشانده شد.

• شانه مخصوص درون قالبی که دو سوی آن با چسب بسته شده بود گذاشته شد.

• پیش از انجماد ژل، به منظور رنگ آمیزی مقدار ۳ میکرولیتر اتیدیوم بروماید به ژل اضافه نموده و سپس محلول به آرامی درون قالب ریخته شد.

• پس از انجماد ژل، چسب ها از دو سوی ژل برداشته و شانه نیز به آرامی بیرون آورده شد.

• ژل همراه با قالب خود داخل تانک الکتروفورز قرار داده و روی آن بافر TBE ×۱ ریخته شد تا ارتفاع بافر به اندازه چند میلی متر بالای ژل قرار بگیرد.

• مقدار ۵ میکرولیتر از محصول واکنش PCR با ۱ میکرولیتر بافر بارگذاری (برمو فنول بلو ۲۵/۰ درصد و گلیسرول ۳۰ درصد) مخلوط و داخل راهک های ژل ریخته شد. سپس دستگاه الکتروفورز به مدت ۴۰ دقیقه با ولتاژ ۱۰۰-۹۰ ولت روشن گردید. پس از اتمام الکتروفورز، ژل داخل دستگاهGel Documentation قرار داده شده و عکس برداری از ژل انجام و نتایج مورد بررسی قرار گرفت.

۳-۲- کاشت گیاه آرابیدوپسیس
به منظور از بین بردن بیمارگرهای مزاحم احتمالی ماسه رودخانه‌ای دو مرتبه اتوکلاو گردید. سپس ماسه را درون لیوان هایی که از ته سوراخ شده بودند ریخته و داخل سینی قرار داده و داخل سینی با آب پر شد. بذور Arabidopsis thaliana (Col-0) به مدت یک دقیقه با هیپوکلریت سدیم و یا وایتکس ٪ ۵ ضدعفونی و ۳ مرتبه با آب مقطر سترون شستشو و سپس در لیوان ها کشت شدند. به منظور حفظ رطوبت کافی، لیوان ها با کیسه فریزر پوشانده شد. سپس ظروف آنها در دمای ۴-۳ درجه سانتیگراد (دمای یخچال) به مدت ۲ تا ۴ روز برای شکستن خواب قرار گرفت. پس از جوانه زنی بذور، لیوان ها در درجه حرارت ۲۵-۲۳ درجه سانتیگراد قرار گرفت. حذف پوشش پلاستیکی ۵-۳ روز پس از جوانه زنی صورت گرفت. دو هفته بعد از جوانه زنی، گیاهچه ها به سیستم هیدروپونیک منتقل و در شرایط گلخانه با دمای ۲۵-۲۳ درجه سانتیگراد نگهداری شدند. برای تهیه بستر سیستم هیدروپونیک از کوکوپیت که برای هوادهی مناسب است استفاده شد.
۳-۲-۱- محیط کشت آرابیدوپسیس
در این تحقیق از محیط کشت مایع هوگلند (Galiba and Kerepesi, 2000) در سیستم هیدروپونیک استفاده گردید. غلظت این عناصر در جدول ۳-۳ مشاهده می شود. به منظور جلوگیری از کمبود اکسیژن و نیز یکنواختی عناصر غذایی درون محیط کشت، از پمپ های آکواریومی استفاده گردید.
جدول۳-۳- نوع و مقدار عناصر غذایی محیط کشت هوگلند