ﻧﮕﺎرش ﻣﻘﺎﻟﻪ ﭘﮋوهشی درباره شناسایی اینتگرونهای کلاس ۱ و ۲ در جدایههای اشریشیاکلای طیور ... |
 |
۷-۲-۳- نکات مورد توجه در اندازه گیری قطر هاله و خواندن نتایج آزمایش آنتی بیوگرام ۴۳
۸-۲-۳- بررسی حضور مقاومت های چند گانه ۴۳
۹-۲-۳- استخراج DNA جهت انجام آزمایشهای مولکولی ۴۴
۱۰-۲-۳- انجام واکنش های زنجیره ای پلیمراز ۵۰
۱۱-۲-۳- انجام واکنش PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز ۱ و ۲ ۵۲
۱۲-۲-۳- الکتروفورز روی ژل آگارز ۵۳
۱۳-۲-۳- شناسایی کاست ژنی اینتگرون ۵۴
۱۴-۲-۳- انجام واکنش PCR برای شناسایی کاستهای ژنی اینتگرون کلاس ۱ ۵۵
۱۵-۲-۳- تعیین ترادف محصولات ۵۶
۱۶-۲-۳- آزمون آماری ۵۶
فصل چهارم: نتایج
۱-۴ نتایج جستجوی اینتگرونهای کلاس ۱ و ۲ ۵۷
۲-۴ نتایج بررسی کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها ۶۳
۳-۴ نتایج تعیین توالی کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها ۶۵
عنوان صفحه
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری ۶۷
فهرست منابع ۷۵
پیوست ۸۹
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول۱-۱: طبقه بندی آنتیبیوتیکها بر اساس مکانیسم اثر ۱۰
جدول ۱-۳: دستگاهها وسائل آزمایشگاهی مورد استفاده ۳۴
جدول ۲-۳: مواد شیمیایی مورد استفاده ۳۵
جدول ۳-۳: آنتیبیوتیکهای استفاده شده برای آنتی‌بیوگرام ۳۹
جدول۴-۳: دیسک‌های آنتی‌بیوتیک استفاده شده، مقادیر ماده موثره آنها
و تفسیر نتایج آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی ۴۱
جدول ۵-۳: خصوصیات روش آزمایش آنتی بیوگرام (دیسک دیفیوژن)
بر اساس معیارهای CLSI (NCCLS) 42
جدول ۶-۳: اطلاعات نمونه های کارشده ، گرفته شده از مزارع گوشتی
شهرستان شیراز ۴۵
جدول ۷-۳: برنامه چرخه حرارتی PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز ۱ واینتگراز ۲ ۵۰
جدول ۸-۳: برنامه چرخه حرارتی PCR برای شناسایی کاست ژنی اینتگرون کلاس۱ ۵۰
جدول۹-۳: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی ژن های
اینتگراز ۱ و اینتگراز ۲ ۵۱
جدول۱۰-۳: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی کاست ژنی
اینتگرون کلاس ۱ ۵۱
جدول۱۱-۳: غلظت استوک مواد اولیه مورد استفاده در واکنش زنجیرهای پلیمراز ۵۱
جدول ۱۲-۳: ساخت محلول کار آماده جهت انجام Multiplex PCR برای شناسایی
ژنهای اینتگراز ۵۲
عنوان صفحه
جدول ۱۳-۳: تهیه بافر TAE 50 بار ۵۳
جدول۱۴-۳: ساخت محلول کار آماده جهت انجام PCR برای شناسایی کاست ژنی
کلاس۱ اینتگرون ۵۵
جدول ۱-۴: مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی
بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز ۵۸
جدول ۲-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ در جدایه های E. coli
جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی ۵۹
جدول ۳-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۲ در جدایه های E. coli
جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی ۶۰
جدول ۴-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲
در جدایه های E. coli جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی ۶۱
جدول ۵-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ و ژن اینتگراز۲ و حضور
همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه ۶۲
جدول ۶-۴: کد نمونه، طول کاست ژنی و ژنهای موجود در کاست ژنی
کلاس ۱ اینتگرونها در محصولات PCR تعیین ترادف شده ۶۶
فهرست تصاویر
عنوان صفحه
تصویر ۱-۱ مکانیزم های توسعه مقاومت به آنتی بیوتیک ۱۹
تصویر ۲-۱ سه مکانیسم اصلی که توسط آن ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی
به صورت افقی در میان باکتری ها منتقل می‌شوند ۲۱
تصویر۳-۱) ساختمان کلی یک اینتگرون ۲۴
تصویر۴-۱: ساختمان کلی کلاس۱ اینتگرونها ۲۵
تصویر ۵-۱: ساختار کلاس ۱ اینتگرون یافت شده در Tn402 26
تصویر۶-۱: ساختار اینتگرون کلاس۲ موجود در Tn7 26
تصویر۷-۱: ساختار اولین اینتگرون کلاس ۳ از ژاپن ۲۷
تصویر۸-۱: ساختار کاستها همراه اینتگرون ۲۸
تصویر۸-۱:ساختار شماتیک کاست وارد شده به اینتگرون ۲۹
تصویر۹-۱: مکانیسم ورود و بیان کاستهای ژنی توسط اینتگرون کلاس۱ ۳۱
تصویر۱-۴: تصوی ژل الکتروفورز ۶۳
تصویر ۲-۴: الگوی باندهای محصولات PCR کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها
با طول متفاوت پس از الکتروفورز روی ژل آگارز ۶۴
تصویر ۳-۴: الگوی باندهای محصولات PCR کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها
با طول متفاوت پس از از الکتروفورز روی ژل آگارز ۶۵
فهرست نمودارها
عنوان صفحه
نمودار۱-۴: درصد مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی
بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز. ۵۸
نمودار ۲-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۱ در جدایه های E. coli
بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه. ۵۹
نمودار ۳-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۲ در جدایه های E. coli
بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه ۶۰
نمودار ۴-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲
در جدایه های E. coli بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه ۶۱
نمودار ۵-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۱ و ژن اینتگراز ۲ و حضور
همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه ۶۲
فصل اول: مقدمه و هدف
۱-۱- مقدمه
کشف آنتی بیوتیک ها در اواخر دههی ۱۹۲۰ و آغاز استفاده از آنها در درمان و جلوگیری از عفونت در دههی۱۹۴۰ بدون شک یکی از پیشرفت‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های بزرگ پزشکی در ۱۰۰ سال گذشته است (دیویس، ۲۰۰۷، دیویس و دیویس، ۲۰۱۰). از آن زمان تا کنون آنتیبیوتیکها به طور گسترده‌ای در درمان بیماری‌های عفونی انسانها و حیوانات استفاده شده‌اند. آنتیبیوتیکها در صنعت طیور به منظور افزایش رشد، درمان، پیشگیری و کوکسیدیواستات استفاده می‌شوند (گوآرداباسی و همکاران، ۲۰۰۸). استفاده گسترده از آنتیبیوتیکها در انسان و حیوانات سبب ایجاد نگرانی‌هایی در مورد توسعه‌ی باکتری های مقاوم و نیز باکتریهای دارای مقاومت چندگانه که یک خطر بالقوه برای جوامع انسانی و حیوانات هستند، شده است، چرا که مقاومت می‌تواند سبب شکست در درمان شود (اریال، ۲۰۰۱).
بر طبق تخمین مرکز” کنترل و پیشگیری بیماری ها (CDC) در ایالات متحده آمریکا سالانه در حدود ۶۰۰۰۰ نفر در کشور آمریکا به علت مقاومت عوامل بیماری زا نسبت به آنتی بیوتیک ها جان خود را از دست می دهند. همچنین تخمین زده می شود که استفاده غیر درمانی از آنتی بیوتیک ها در چارپایان اهلی ۸۰% از کل آنتی بیوتیک های استفاده شده در ایالات متحده را شامل می شود.
صنعت طیور دومین صنعت کشور ما محسوب میشود. با این حال به علت نبود سیستم نظارتی دقیق، آنتیبیوتیکها به شکلی خودسرانه و غیر معقول درطیور صنعتی مصرف می‌شوند. مشکل مهمی که استفاده غیر اصولی از آنتیبیوتیکها ایجاد می‌کند، بقایای این داروها در محصولات دامی، خصوصا گوشت ماکیان و تخم مرغ میباشد که علاوه بر انتقال به انسان و افزایش فشار بر کبد وکلیه‌ها برای دفع دارو، سبب ایجاد مقاومت در میکروارگانیسمهای انسانی در اثر مواجهه آنها با این بقایای آنتی‌بیوتیکی میشود.
با ظهور باکتریهای مقاوم به چندین آنتی بیوتیک درمان عفونتها در سرتاسر جهان به خطر افتاده است. گرچه به صورت کلاسیک مقاومت را به جهش های کروموزومی نسبت می دهند. اما مقاومت غالبا در ارتباط با قطعات خارج کروموزومی است که از سایر باکتریهای موجود در محیط کسب می شود که این‌ها شامل انواع مختلفی ازقطعات DNA متحرک، مثل پلاسمیدها، ترانسپوزونها و اینتگرونها هستند. به محض اینکه باکتریهای دارای مقاومت مستقر شدند، دوام آورده و در سرتاسر جهان پخش می شوند و سبب شکست بالینی در درمان عفونتها و ایجاد بحرانهای بهداشت عمومی می‌شوند (الکسون و لوی، ۲۰۰۷). اینتگرونها قطعات ژنتیکی باکتریایی هستند که می توانند سبب افزایش جذب و بیان ژن ها (عموما ژنهای مقاومت) در داخل کاستهای ژنی خود شوند (استوکس و هال، ۱۹۸۹). اینتگرونها عموما بر اساس توالی پروتئین اینتگراز که عملکرد نوترکیبی را به آنها می‌دهد، طبقه بندی می شوند. بر اساس این توالی اینتگرونهای مقاومت (RIs ) به ۵ دسته طبقه بندی شده اند ، که از میان آنها بیشترین حجم مطالعات بر روی کلاس ۱ و۲ و۳ انجام شده است. بیش از ۱۳۰ کاست ژنی مختلف شناسایی شده است که سبب ایجاد مقاومت به (تقریبا) تمام آنتی بیوتیک ها می شوند (مازل، ۲۰۰۶). کاست های ژنی که تا امروز در اینتگرونها شناسایی شده اند معمولا فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می کنند. بنابراین به این اینتگرونها، اینتگرونهای مقاومت (RIs [۱]) یا اینتگرونهای مقاومت چندگانه دارویی (MRIs [۲])گویند (استالدر و همکاران، ۲۰۱۲). ژنهای مقاومت به هم پیوسته بر روی اینتگرونها (که قطعات ژنتیکی متحرک هستند) مقاومت های دارویی چندگانه را رمزگردانی می کنند و در انتقال مقاومت های دارویی چندگانه بین باکتری ها دخیل هستند (لوراستین هال و همکاران، ۲۰۰۳).
مواجهه با باکتریهای دارای مقاومت چندگانه از طریق زنجیره ی غذایی خطر بالقوه ای برای سلامت انسان از طریق عفونتهای منتقل شونده از راه غذا در نظر گرفته شده است. مسبب آن پاتوژنهای مقاوم یا انتقال افقی اینتگرونها از باکتریهای موجود در حیوانات تولید کننده غذا [۳] مثل طیور به پاتوژنهای انسانی میباشد (باکس و همکاران، ۲۰۰۵). اینتگرونها در سرتاسر جهان در ارتباط با باکتری های گرم منفی توصیف شده اند و شاخصی برای مقاومت آنتی بیوتیکی هستند (باهو و همکاران، ۲۰۱۰).
کلاس یک اینتگرونها به علت پخش وسیع در میان باکتریهای گرم منفی وبالاترین میزان گزارشات در انسان و حیوانات به طور گسترده‌ای مورد مطالعه قرار گرفته اند. این کلاس شایعترین اینتگرون در جدایههای کلینیکی است وسبب شده برخی نویسندگان آنها را اینتگرونهای بالینی[۴] نامگذاری کنند (گیلینگز و همکاران، ۲۰۰۸). کلاس ۲ اینتگرونهای متحرک ، دومین گروه فراوان اینتگرونها هستند . در اغلب اینتگرونهای کلاس ۲ ژن intI2 بوسیله ی یک کدون پایان منقطع میشود که منجر به تولید یک پروتئین ناقص و غیر عملکردی میشود که باعث ایجاد یک ترتیب پایدار در کاستهای ژنی میشود که اساسا شامل ژن مقاومت به تری متوپریم dfrA1 ،ژن مقاومت به استرپتو تریسین sat2 ، ژن مقاومت به استرپتومیسین و اسپکتینومیسین aadA1 و ژن با عملکرد نامشخص orfX هستند (هانسون و همکاران، ۲۰۰۲). فشار آنتی بیوتیکی احتمالا نقش مهمی درانتخاب وپخش اینتگرونهای متحرک در باکتریها ایفا کرده است. بیش از ۱۳۰ کاست ژنی که سبب مقاومت آنتی‌بیوتیکی می‌شوند و بیش از ۶۰ کاست ژنی با عملکرد نا شناخته در رابطه با اینتگرونهای متحرک شناسایی شده اند (پارتریج و همکاران، ۲۰۰۹). ژنهایی که درون این کاست های ژنی جاسازی شده اند شامل ژنهای مقاومت به تقریبا تمام خانواده‌های آنتی بیوتیکی، شامل: بتا-لاکتام ها، آمینوگلیکوزیدها، تریمتوپریم، کلرآمفنیکل، فسفومیسین، ماکرولیدها، لینکوزآمیدها، ریفامپیسین و کوئینولون‌ها هستند. علاوه بر آن کاستهای ژنیqac که فاکتورهای مقاومت به مواد ضد عفونی کننده از خانواده ترکیبات چهار تایی آمونیوم را رمزگردانی می‌کنند در اینتگرونهای متحرک یافت شده اند. مطالعات نشان داده اند که اینتگرونهای متحرک (MIs ) در جوامع باکتریایی که به طور مستقیم یا غیر مستقیم در کلینیک‌ها یا کشاورزی یا محیط در معرض فشار آنتی‌بیوتیکی قرار گرفته اند، شیوع بیشتری داشته است (استادر و همکاران، ۲۰۱۲).
از آن جهت که تا کنون پژوهشی در جهت شناسایی اینتگرونها در باکتریهای جدا شده از طیور گوشتی استان فارس انجام نشده و نقش آنها در ایجاد مقاومت‌های چندگانه در ماکیان استان بررسی نشده است و همچنین با توجه به نقش بسیار مهم اینتگرونها در شیوع مقاومت های آنتی بیوتیکی چندگانه در بین پاتوژنهای حیوانی و همچنین انسانی و انتقال باکتریهای طیور از طریق زنجیره‌ی غذایی به انسانها و نیز خطر انتقال فاکتورهای مقاومت از باکتریهای ماکیان به سایر باکتریهای موجود در محیط و باکتریهای فلور حیوانات و انسانها، به نظر می‌رسد نتایج این پایان نامه در خصوص تعیین حضور و فراوانی اینتگرونها در جدایههای اشریشیا‌کولی طیور گوشتی منطقه منجر به کسب اطلاعات مفیدی در زمینه مکانیسم‌های انتقال مقاومت آنتی‌بیوتیکی و ایجاد باکتریهای دارای مقاومت چندگانه در باکتریهای ماکیان خواهد شد.
۱-۲- فرضیه ها و اهداف طرح
آیا اینتگرونهای کلاس ۱و۲ در جدایههای E. coli طیور گوشتی مورد مطالعه وجود دارد؟
کدامیک از اینتگرونهای کلاس ۱و۲ بیشترین فراوانی را در جدایههای موجود دارند ؟
آیا میان حضور اینتگرونها و مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی در جدایههای مورد مطالعه ارتباطی وجود دارد ؟
فصل دوم: کلیات و بررسی منابع موجود
۱-۲- اشریشیا کولی
باکتری اشریشیا کولی متعلق به جنس اشریشیا[۵] از خانواده انتروباکتریاسه[۶] می باشد. اشریشیا کولی یک باسیل گرم منفی، غیر اسیدفست، چند شکلی و غیر اسپورزا میباشد. اغلب سویه‌های این باکتری متحرک و دارای تاژک میباشند (کوئین و همکاران. ۱۹۹۴ب).
۱-۱-۲-خصوصیات کشت
اشریشیا کولی بصورت هوازی یا بی‌هوازی بر روی محیط کشت های معمولی و در بازه دمایی ۴۴-۱۸ درجه سانتیگراد رشد می‌کند. این باکتری بر روی پلیت‌های آگار در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد در عرض ۲۴ ساعت رشد کرده و کلنی‌های صاف، محدب و بی‌رنگی را تولید می‌کند. کلنی‌های اشریشیا کولی بر روی آگار مک کانکی صورتی درخشان، بر روی آگار EMB [۷] سبز تیره با جلای فلزی دیده می‌شوند. اگرچه شکل کلنی‌های اشریشیا کولی متغیر است ولی معمولاَ mm 3-1 قطر داشته و دارای یک ساختار گرانوله و لبه‌های کامل میباشند. کلنی‌های خشن، بزرگ و دارای لبه‌های منظم هستند. درحالیکه کلنی‌های موکوئیدی بزرگتر بوده و خیس وچسبنده به نظر می‌رسند. برخلاف اشریشیا کولی‌های بیماریزای پستانداران که به طور معمول بر روی آگار خون دار ایجاد همولیز می‌کنند، همولیز چهره معمول اشریشیا کولی‌های بیماریزای طیور نیست (رودریگز و همکاران ۲۰۰۵).
۲-۱-۲-خصوصیات بیوشیمیایی
اشریشیا کولی از تخمیر گلوکز، مالتوز، مانیتول، زیلوز، گلیسرول، رامنوز، سوربیتول وآرابینوز اسید و گاز تولید می‌کند اما دکسترین، نشاسته و اینوزیتول را تخمیر نمی‌کند. جایگزینی سوربیتول به جای لاکتوز در آگار مک کانکی برای تفریق اشریشیا کولی O157 از دیگر جدایه های اشریشیا کولی بکار می رود زیراکه O157:H7 سوربیتول را تخمیر نکرده و نمی تواند بر روی مک کانکی کلنی‌های صورتی رنگ ایجاد کند (مارچ و رتنام، ۱۹۸۶). اغلب جدایههای اشریشیا کولی لاکتوز را تخمیر می‌کنند ولی برخی سویه‌های اشریشیا کولی لاکتوز منفی وجود دارند که می بایست از سالمونلا تفریق داده شوند (بارنز و همکاران، ۲۰۰۸ب). اشریشیا کولی اندول تولید کرده، واکنش متیل رد مثبت داشته و نیترات را به نیتریت تبدیل می‌کند. واکنش های ووژ- پروسکوئر[۸] و اکسیداز آن منفی است و در محیط آهن دار سولفید هیدروژن تولید نمی‌کند. اشریشیا کولی در حضور سیانید پتاسیم رشد نمی‌کند. اوره را هیدرولیز کرده (اوره آز منفی است)، ژلاتین را ذوب و بر روی محیط سیترات رشد می‌کند. از آزمایشهای بیوشیمیایی می‌توان برای تمایز اشریشیا کولی از دیگر گونه‌های جنس اشریشیا استفاده کرد (بتل هایم، ۱۹۹۴؛ جیلس، ۱۹۹۴).
۳-۱-۲-انتشار و راه های انتقال اشریشیا کولی در طیور
سروتیپ های مختلف اشریشیا کولی فلور نرمال روده بوده و در تعداد زیاد در دستگاه گوارش بسیاری از موجودات از جمله انسان دیده می‌شوند. حضور اشریشیا‌کولی در روده بسیار مفید بوده و می تواند از جایگزین شدن سایر باکتری ها مانند سالمونلا ممانعت کند (مورر و همکاران، ۲۰۰۲). باکتریهای روده نقش مهمی در پاتوژنز بیماری‌های روده بازی می‌کنند، زیرا اعتقاد بر این است که آنها از روده در برابر کلونیزه شدن پاتوژنها جلوگیری می‌کنند و سبب تحریک پاسخ ایمنی در جوجه ها می‌شوند (مید، ۲۰۰۰). خوراک طیور می‌تواند به طور مستقیم یا غیر مستقیم از طریق تماس با خاک، جوندگان، پرندگان، گرد و غبار، انسان به عنوان حامل، فاضلاب یا آب در طول پردازش و ذخیره سازی آلوده شود. در تجزیه و تحلیل میکروبیولوژیکی مواد غذایی، اعضای انتروباکتریاسه به طور معمول به عنوان شاخص آلودگی مدفوعی عمل می‌کنند و شامل باکتریهای مهم مشترک انسان و دام مثل گونه‌های سالمونلا، گونه‌های یرسینیا و اشریشیا‌کولی هستند (میراندا و همکاران، ۲۰۰۸). در مطالعه‌ای به منظورجداسازی و شناسایی انتروباکتریاسه و غیر انتروباکتریاسه از دستگاه گوارش ماکیان در سطح جنس و گونه، نشان داده شد که شایع ترین انتروباکتریاسه موجود در نمونهها اشریشیا کولی (۳۳/۵۸ %) بود (یهیا وهمکاران، ۲۰۱۳). در ماکیان نرمال، ۱۵-۱۰ درصد کلی‌فرم‌های روده‌ای ممکن است به سروتیپ های بالقوه پاتوژن تعلق داشته باشند (هری و همزلی، ۱۹۶۵ب). گرچه این سروتیپ‌های روده‌ای ممکن است مشابه سروتیپ‌های خارج روده‌ای بیماریزا در همان پرنده نباشند ولی می‌توانند به عنوان مخزنی برای فاکتورهای حدت و فاکتورهای مقاومت باکتریایی عمل کنند (نوگرادی و همکاران، ۲۰۰۶). باکتریهای اشریشیا‌کولی بیماریزا می توانند از طریق تخم مرغ منتقل شده وسبب مرگ و میر بالا در جوجه های جوان گردند (روزاریو و همکاران، ۲۰۰۴). کولی فرم های بیماریزا در روده جوجه‌های تازه از تخم در آمده بسیار فراوان تر از تخم مرغ هایی هستند که از آن ها تفریخ شده‌اند. این امر نشان دهنده گسترش سریع این سویه ها بلافاصله پس از تفریخ است (هری وهمزلی، ۱۹۶۵الف). به نظر می‌رسد که مهمترین منبع آلودگی تخم مرغ ها آلودگی مدفوعی سطح تخم مرغ ها باشد که از طریق پوسته تخم مرغ به داخل نفوذ می‌کند (بارنز و همکاران، ۲۰۰۸الف). دان مصرفی و سایر اجزاء جیره غذایی طیور اغلب به راحتی با کلی فرم های بیماریزا آلوده شده و منابع متداولی برای معرفی سروتیپ های جدید به گله های طیور محسوب می شوند (دا کوستا و همکاران، ۲۰۰۷). مدفوع جوندگان نیز محتوی سویه های بیماریزای اشریشیا‌کولی میباشد. دستگاه گوارش موش ها محیط مناسبی برای انتقال ژنهای مقاومت آنتی‌بیوتیکی از سویه‌های مقاوم به سویه‌های حساس است (هارت و همکاران، ۲۰۰۶). سروتیپ های بیماریزا ممکن است که از طریق آب چاه آلوده به گله های طیور منتقل شوند. حضور اشریشیا کولی در آب آشامیدنی نشان دهنده آلودگی مدفوعی بوده و می تواند نشانگر انتقال مدفوعی-دهانی عامل بیماریزا باشد (بارنز و همکاران، ۲۰۰۸الف).
۲-۲-آنتی‌بیوتک‌ها
۱-۲-۲- تعریف
آنتیبیوتیکها عواملی هستند که با کشتن یا مهار رشد سلولهای باکتریایی بر آنها اثر می‌گذارند. آنها محصولات فرعی طبیعی ارگانیسم‌هایی مثل باکتریها و قارچ ها هستند. واژه آنتی‌بیوتیک در اصل فقط آن دسته از ترکیبات مشتق شده از منشاء میکروبی را توصیف می‌کند، با این حال در حال حاضر این تعریف شامل هر ترکیب با وزن مولکولی کم میشود که یا از میکروب‌ها یا از سایر موجودات زنده و یا حتی از منشاء نیمه سنتزی یا مصنوعی است که می‌تواند رشد میکروارگانیسمهای دیگر را مهار و یا آنها را نابود کند. اکثریت آنتیبیوتیکهای مورد استفاده در طب انسانی و دامپزشکی محصولات طبیعی تولید شده توسط سه گروه اصلی از میکروارگانیسم ها شامل: اکتینومایست‌ها، باکتریها و قارچ های رشته‌ای، هستند. اکتینومایست‌ها بیشترین تعداد و بیشترین انواع آنتی بیوتیکها را تولید می‌کنند (بیش از شش هزار ماده از آنها جدا شده) (کیز وهمکاران، ۲۰۰۸). آنتیبیوتیکها برای درمان بیماری و عفونت، به منظور پیشگیری در جراحی‌ها، به عنوان بهبود دهنده‌ی رشد در مزارع پرورشی، به عنوان درمان‌های پیشگیرانه در کشاورزی و برای تحقیقات در میکروبیولوژی و زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شوند (دیویس، ۱۹۹۰).
۲-۲-۲-سابقه تاریخی
با ابداع پنی‌سیلین و داروهای سولفونامیدی و استفادهی بالینی آنها به ترتیب در دهه های ۱۹۳۰و۱۹۴۰ میلادی (کوهن، ۲۰۰۰) درمان بیماری‌های عفونی پیشرفت کرد. موفقیت بالینی این داروها و نیاز به درمان عفونت های باکتریایی در زخمهای ایجاد شده در اثر جنگ در خلال جنگ جهانی دوم منجر به کشف آنتیبیوتیکهای مختلف از جمله استرپتومایسین، کلرامفنیکل، تتراسایکلین، اریترومایسین، ریفامایسین، وانکومایسین و سفالوسپورین ها بین سال های ۱۹۴۰و۱۹۶۰ شد (یونیاماتا و کاتسوماتا، ۲۰۰۶). تاثیر قابل توجه آنتیبیوتیکها منجر به خوشبینی برای درمان بیماری‌های عفونی شد. اما باکتریها بلافاصله پس از استفاده از هر داروی جدید مقاومت علیه آنرا ظاهر کردند وسبب ظهور مجدد عفونت‌هایی شدندکه سابقا تجربه شده بود و به نظر می‌رسید این بار بدخیم‌تر شده باشند (کوهن، ۲۰۰۰).
۳-۲-۲-طبقه بندی آنتی‌بیوتیک ها
دسته‌ه ای متفاوتی از آنتیبیوتیکها وجود دارند که هر کدام قسمت متفاوتی از سیستم رشد سلول باکتری را هدف قرار می‌دهند. این مواد یا باکتریواستاتیک یا باکتریوسیدال هستند. بتا-لاکتام‌ها و سفالوسپورین‌ها آنتیبیوتیکهای باکتریوسیدال هستند که سنتز دیواره سلولی را مهار می‌کنند (تیورتزباکر، ۱۹۹۸). آنها سبب غیر فعال شدن پروتئین‌های باند‌شونده به پنی‌سیلین[۹] می‌شوند که این پروتئین‌ها، آنزیم‌هایی هستند که در اتصالات عرضی پپتیدوگلیکان[۱۰] دخیل هستند. این آنتیبیوتیکها فقط سلولهای در حال رشد را می‌کشند. تتراسایکلین ها عوامل باکتریواستاتیکی هستند که با اتصال به زیرواحد ۳۰S ریبوزومی ومهار اتصال tRNAحامل اسید‌آمینه مانع از سنتز پروتئین می‌شوند (تیلور و چاو، ۱۹۹۶). آمینوگلیکوزیدها دسته‌ای از آنتیبیوتیکها با طیف گسترده‌ای از اعضاء هستند که با اتصال به زیرواحد ۳۰S ریبوزومی و ایجاد اشتباه در خواندن mRNA سنتز پروتئین را مهار می‌کنند (رکیا و هال، ۱۹۹۵ب). کینولون ها، عوامل ضد میکروبی باکتریوسیدال هستند که از طریق تعامل با DNA gyrase و توپوایزومراز، سبب مهار فعالیت آنزیمی و مهار باز شدن رشته‌های در هم پیچیده DNA شده و همانند‌سازی DNA را مهار می‌کنند (هوپر، ۱۹۹۹). کلرامفنیکل با اتصال به زیرواحد ۵۰S ریبوزومی و اثر مهاری بر peptidyltransferase دارد سبب مهار سنتز پروتئین میشود (موری و شاو، ۱۹۹۷).
طبقه بندی آنتیبیوتیکها بر اساس مکانیسم اثر به طور خلاصه در جدول زیر آورده شده است.
جدول۱-۱: طبقه بندی آنتیبیوتیکها بر اساس مکانیسم اثر (طبقه بندی آنتیبیوتیکها و مکانیسم عمل آنها، ۲۰۱۳)
| Antibiotic Grouping By Mechanism | |
| Cell Wall Synthesis | Penicillins Cephalosporins Vancomycin Beta-lactamase Inhibitors Carbapenems Aztreonam Polymycin Bacitracin |
| Protein Synthesis Inhibitors | Inhibit 30s Subunit Aminoglycosides (gentamicin) Tetracyclines Inhibit 50s Subunit Macrolides Chloramphenicol Clindamycin Linezolid Streptogramins |
| DNA Synthesis Inhibitors | Fluoroquinolones |
| RNA synthesis Inhibitors | Rifampin |
| Mycolic Acid synthesis inhibitors | Isoniazid |
| Folic Acid synthesis inhibitors | Sulfonamides Trimethoprim |
۴-۲-۲- استفاده از آنتی بیوتیک در حیوانات مولد غذا[۱۱]
استفاده از آنتی بیوتیکها در حیوانات مولد غذا مدت کوتاهی پس از جنگ جهانی دوم آغاز شد. مور و همکاران پیشنهاد کردند که آنتیبیوتیکها در آب و غذای حیوانات استفاده شوند، زیرا به نظر می‌رسید آنها سرعت رشد ماکیان را ارتقا می بخشند (مور و همکاران، ۱۹۴۶). از آن زمان، پژوهش‌های بعدی به گزارش مزایای دوزهای تحت درمانی آنتیبیوتیکها (که توسط سازمان غذا و داروی آمریکا کمتر از ۲۰۰ گرم در هر تن غذا معین شده) که در حیوانات متفاوت از جمله خوک وگاو آزمایش شده بود، پرداخت (کانها و همکاران، ۱۹۵۰؛ لوسلی و والاس، ۱۹۵۰؛ پرسکات، ۲۰۰۶). این مکانیسم که چگونه آنتیبیوتیکها سبب بهبود سرعت رشد و بازده خوراک می‌شوند هرگز به خوبی درک نشده است. با این حال نظریه‌های متعددی پیشنهاد شده است از جمله: ۱) اثرات بیوشیمیایی که شامل دفع نیتروژن، افزایش بهره وری وراندمان در فسفوریلاسیون سلولها و سنتز پروتئین ۲) اثرات آنتیبیوتیکها روی تولید ویتامین‌ها وکوفاکتورهای ضروری توسط میکروفلور روده و ۳) کاهش در جمعیت ارگانیسم‌های بیماریزای تحت بالینی (کرامول، ۱۹۹۱). همچنین استفاده از آنتیبیوتیکها سبب کاهش تولید کود و در نتیجه کاهش اثرات ضایعات حیوانی بر محیط زیست شده (راث و کرشجسنر، ۱۹۹۳) و کاهش بار پاتوژن حیوانات و کاهش حمل پاتوژن های منتقله از طریق غذا[۱۲] در دامها را سبب میشود (ابنر و متیو، ۲۰۰۰؛ کریاکیس و همکاران، ۱۹۹۶). بسیاری از پاتوژن های منتقل شده از طریق غذا به راحتی با واکسیناسیون در دامها قابل کنترل نیست و چون این موجودات ارتباط همسفرگی با میزبان خود (حیوانات مولد غذا) دارند ریشه‌کن کردن آنها اگر غیرممکن نباشد، دشوار است. با این حال، محدود کردن تعداد آنها در روده با غذاهای مبتنی برآنتی بیوتیک ها یا افزودن آنتیبیوتیکها به صورت مکمل های آب ممکن است یک رویکرد عملی برای محدود کردن انتقال این ارگانیسم های قابل انتقال با غذا باشد (فیلیپس و همکاران، ۲۰۰۴). در دامداری، استفاده از آنتی‌بیوتیک به ۴ هدف انجام میشود (شوارتز و چاسلوس-دانکلا، ۲۰۰۱) در مرحله اول، درمانی است که در نظر دارد عفونت باکتریایی موجود را با درمان حیوانات آلوده کنترل کند. دوم، اقدام درمانی که هدف آن درمان حیوانات آلوده و همچنین دارو دادن به حیوانات دیگر برای هدف پیشگیری است. سوم، درمان پیشگیری است که در طول دوره خطر بالای سرایت عفونت به عنوان یک اقدام پیشگیرانه اعمال می شود اما حیوانات بیمار را درمان نمی‌کنند (مثلا هنگام جابجایی یا از شیرگیری دام). و در نهایت، استفاده از عوامل آنتی بیوتیکی برای هدف ارتقاء رشد.
تتراسایکلین، پنی سیلین، اریترومایسین و سایر داروهای مورد استفاده در طب انسانی به طور گسترده در پرورش حیوانات مولد غذا استفاده می‌شوند. یک مطالعه که توسط دانشمندان در سال ۲۰۰۱ منتشر شد بیان کرد که حدود ۶/۲۴ میلیون پوند آنتی‌بیوتیک در حیوانات استفاده میشود، که بخش عمده آن مربوط به استفاده آنها در تولید ماکیان است که از دهه ۱۹۸۰ افزایش چشمگیر ۳۰۷ درصدی داشته است. برآوردهای آنها عنوان کرد که استفادهی غیر درمانی در دامها ۷۰ درصد کل استفاده آنتی‌بیوتیکی را شامل میشود (ملون و همکاران، ۲۰۰۱). آمار و ارقام بدست آمده درمطالعه‌ی این دانشمندان بر اساس روش های غیر مستقیم و تعمیم دهی[۱۳] بوده است و برآورد میزان دقیق آنتیبیوتیکها برای حیوانات هنوز هم نیاز به روشن کردن این نکته دارد که داروها برای چه منظور و در چه مقدار استفاده می شود.
۱-۴-۲-۲-مصرف آنتیبیوتیکها در طیور
به طور کلی آنتی بیوتیک ها در صنعت طیور برای اهداف درمانی، غیردرمانی و ارتقاء رشد استفاده میشود (سی وی پی، ۲۰۰۶؛ لو و همکاران، ۲۰۰۶)
امروزه تولید جوجه های گوشتی بسیار نظام‌مند و متراکم شده است. این ادغام منجر به نیاز به شیوه های استاندارد از جمله روش های درمان دارویی برای به حداقل رساندن عفونت در میان گله شده است. آنتیبیوتیکها معمولا از طریق آب و غذا به کل گله ماکیان تجویز میشود چرا که درمان‌های فردی عملی نیست. برای مثال، آنتی بیوتیک‌هایی از قبیل یونوفورها و سولفونامیدها که برای کنترل کوکسیدیوز (یک بیماری انگلی که بوسیله‌ی تک یاخته کوکسیدیا ایجاد میشود) استفاده می شوند در جیره جوجه های گوشتی موجود میباشد. باسیتراسین، کلرتتراسایکلین، پنی سیلین، ویرجینیامایسین و ترکیبات آرسنیک در جهت ارتقاء رشد و بازده خوراک در جوجه های گوشتی، بوقلمون ها، و طیور تخمگذار تایید شده‌اند (ان آر سی، ۱۹۹۹). تولید مرغ گوشتی تقریبا همیشه شامل مصرف یک کوکسیدیواستات، ترکیب آرسنیکی و یک آنتی بیوتیک برای بهبود بازده خوراک و افزایش وزن بدن و کاهش عوارض و مرگ و میر میباشد (ان آر سی، ۱۹۹۹). آنتی بیوتیک های محرک رشد مورد استفاده در تولید طیور در ایالات متحده شامل کلرتتراسایکلین، باسیتراسین، تایلوزین، بامبرمایسین و ویرجینیامایسین میباشد (سی وی پی،۲۰۰۶). بیماری های باکتریایی، از جمله کلی‌باسیلوز، انتریت ناشی از گونه‌های کلستریدیوم، مایکوپلاسموزیس، و انواع مختلفی از سالمونلوز، باعث ضررهای اقتصادی قابل توجهی به صنعت طیور می‌شوند (بارنز و همکاران، ۲۰۰۸ب) و دلیل اصلی برای درمان آنتی‌بیوتیکی در طیور هستند (سینگر و هوفکر،۲۰۰۶) آنتی بیوتیک های متداول مورد استفاده برای کنترل این ارگانیسم‌ها شامل سولفونامیدها، آموکسی سیلین، تتراسیکلین، ویرجینیامایسین، تایلوزین، نئومایسین، و پنی سیلین هستند. تا همین اواخر، انروفلوکساسین، داروی فلوروکینولونی، برای کنترل کلی‌باسیلوز مورد تائید بود. با این حال، نگرانی در مورد اینکه استفاده از فلوروکینولون‌ها در طیور ممکن است با عفونت کمپیلوباکتر مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک در انسان مرتبط باشد (پیداک، ۱۹۹۵؛ مورفی و همکاران،۱۹۹۶؛ چو و همکاران،۲۰۰۴) سبب شد سازمان غذا و داروی آمریکا در سال ۲۰۰۵ استفاده از این دارو را در طیور ممنوع کند (اف دی آ، ۲۰۰۵). تخم مرغ‌های نطفه‌دار نیز ممکن است برای کاهش آلودگی به مایکوپلاسما و باکتریها در جنتامایسین غوطه ور شوند (مک یووین و فدورکا-کری، ۲۰۰۲).
پیامدهای استفاده از آنتی بیوتیک ها در حیوانات مولد غذا
مطالعات نشان می‌دهد آنتی‌بیوتیک‌هایی که در حیوانات مولد غذا استفاده می شوند باکتریهای مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک همزیست، از جمله انتروکوکوس و اشریشیا‌کولی غیرپاتوژن و عوامل آنتروپاتوژن‌های مشترک انسان و دام مانند سالمونلا، کامپیلوباکتر، یرسینیا و اشریشیا‌کولی پاتوژن را انتخاب می‌کند (لینتون و همکاران ۱۹۷۵؛ لوی و همکاران، ۱۹۷۶؛ انتز وهمکاران، ۱۹۹۱؛ لو و همکاران،۱۹۹۷). در هر حال، آنتی بیوتیک های مورد استفاده در حیوانات مولد غذا فشار انتخابی را فراهم می‌کند که باکتریها را وادار به توسعه‌ی مکانیسم‌های مقاومت کرده و آشکارا به انتشار مقاومت آنتی بیوتیکی در میان باکتری ها کمک می‌کند.
از آنجا که بسیاری از آنتی بیوتیک های مورد استفاده در حیوانات مولد غذا متعلق به گروههایی از آنتی بیوتیکها هستند که در طب انسانی مورد استفاده قرار می گیرد، ظهور باکتریهای مقاوم به آنتی‌بیوتیک، به نگرانی ویژه ای در سلامت مواد غذایی تبدیل شده است (شی، ۲۰۰۳). سویه های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک آنتروپاتوژن های مشترک انسان و دام و همچنین سویه‌های همزیست به احتمال زیاد از طریق زنجیره غذایی به انسان منتقل می‌شوند. هولمبرگ وهمکاران در سال ۱۹۸۴ گزارش کردند که عفونت سالمونلایی با مصرف همبرگر آلوده به سالمونلا انتریکا سرووار نیوپورت مقاوم در برابر آنتیبیوتیکهای آمپی سیلین، کاربنیسیلین، و تتراسایکلین، ارتباط داشت. منشاء پاتوژنهای مسبب به گوشت گاوهایی در داکوتای جنوبی برمی‌گشت که با دوز تحت درمانی[۱۴] از کلرتتراسایکلین به عنوان محرک رشد تغذیه شده بودند. درمان آنتی بیوتیکی در طول کلونیزه شدن باکتریهای مقاوم به آنتی بیوتیک، ممکن است سبب پیشرفت به حالت بیماری بالینی شود. اثرات انتخابی ارائه شده توسط آنتی بیوتیک های تجویز شده در درمان دارویی، یک مزیت خاص برای برخی از پاتوژنهای مقاوم ایجاد می‌کند تا رشد بیشتری نسبت به میکروفلور دستگاه گوارش داشته باشند (هملمبرگ و همکاران، ۱۹۸۴). در سال ۲۰۰۱ در هلند نسبت باکتریهای اشریشیا‌کولی مدفوعی مقاوم در طیورگوشتی و بوقلمون و مرغان تخم گذار که به جیره آنها آنتی بیوتیک اضافه شده بود و درنمونه‌های مدفوعی پرورش دهندگان طیور گوشتی، بوقلمون و مرغان تخم گذار وکشتار کنندگان طیور گوشتی و بوقلمون تعیین شد که نتایج آن حاکی ازانتقال مقاومت از طیور به انسان بودند (ون دن بوگارد و همکاران، ۲۰۰۱). مواجهه با باکتریهای دارای مقاومت چندگانه از طریق زنجیره ی غذایی خطر بالقوه ای برای سلامت انسان از راه عفونتهای منتقل شونده از غذا[۱۵] در نظر گرفته شده که یا پاتوژن های مقاوم یا انتقال افقی اینتگرونها از باکتریهای موجود در حیوانات تولید کننده غذا ) food-producing animals مثل طیور) به پاتوژنهای انسانی مسبب آن است (باکس و همکاران، ۲۰۰۵).
افزایش سطح مقاومت باکتریایی درمان آنتی بیوتیکی را کمتر موثر می سازد. شکست درمان به علت افزایش مقاومت سالمونلا به فلوروکینولون‌ها مانند سیپروفلوکساسین و نالیدیکسیک اسید از دههی۱۹۹۰ گزارش شده است (موری و همکاران، ۲۰۰۵). درمان عفونت ایجاد شده با سویه‌های باکتریایی مقاوم در برابر آنتی بیوتیک با توجه به انتخاب محدود درمانی پس از تشخیص و افزایش حدت سویه‌های دارای مقاومت آنتی بیوتیکی، سخت تر می شوند (مالباک، ۲۰۰۶)
باکتری های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک با منشاء حیوانی می تواند سبب بیماری‌های جدی در انسان وشکست در درمان دارویی هم در دامپزشکی وهم در طب انسانی شود، بنابراین استفاده محتاطانه‌تر از آنتیبیوتیکها برای کنترل ظهور و گسترش پاتوژن های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک مورد نیاز است.
انتقال باکتریهای حامل ژنهای مقاومت از طریق غذا محتمل‌ترین راهی است که از طریق آن استفاده از آنتی بیوتیکها در کشاورزی می تواند بر سلامت انسان تاثیر گذارد. با این حال، برخی از شواهد برای انتقال مستقیم باکتری های مقاوم در برابر آنتی بیوتیک از حیوانات به انسان گزارش شده است (هومل و همکاران، ۱۹۸۶؛ هانتر و همکاران،۱۹۹۴؛ باکس و همکاران،۲۰۰۵؛ جانسون و همکاران، ۲۰۰۷).
بنابراین انتقال ژنهای مقاومت واینتگرونها ی حاوی مقاومت های چندگانه که دراثر مصرف بی رویه آنتی بیوتیکها ایجاد شده اند، ازباکتریهای فلور به انواع پاتوژن، خطر بالقوه ای برای سلامت ماکیان محسوب می شودکه از طریق بی اثر کردن آنتی بیوتیکهای موجود باعث تحمیل هزینه های درمانی زیاد به مرغداران و افزایش تلفات ماکیان شده که منجر به بالا رفتن قیمت نهایی مرغ شده و می تواند سبب خسارات جدی به صنعت طیور و آسیب به چرخه ی اقتصادی کشور شود، همچنین خطر بهداشت عمومی و انتقال این ژنها به پاتوژنهای انسانی، درمان عفونتهای انسانی را باشکست مواجه خواهد کرد وسبب بی اثر شدن طیف وسیعی از آنتی بیوتیکهای موثر جدید و رایج می شود.
۵-۲-۲- منشاء مقاومت به آنتی بیوتیک
این موضوع به خوبی شناخته شده است که تعدادی از گونه های باکتریایی و قارچی دارای توانایی تولید ترکیبات آنتی بیوتیک هستند که به طور معمول برای به دست آوردن مزیت رقابت در محیط های غنی از میکروارگانیسم، از جمله خاک و بیوفیلم میباشد (آمابیلی-کوئواس و شیکیورل، ۱۹۹۲). پس این احتمال وجود دارد که آنتی بیوتیکهای طبیعی بسیار پیش از آنکه اولین عوامل آنتی بیوتیکی به استفاده بالینی معرفی شوند در محیط زیست موجود بوده‌اند (شوارتز و چاسلوس-دانکلا، ۲۰۰۱). مقاومت آنتی بیوتیکی نیز به احتمال زیاد در طبیعت قبل از استفاده انسان از مواد دارویی، پدید آمده است، زیرا ارگانیسم های تولیدکننده ترکیبات آنتی‌بیوتیکی نیاز به وسیله‌ای برای زنده ماندن در حضور محصولات خود داشتند، و گونه های رقیب نیز راه هایی برای مقابله با اثرات این ترکیبات یافتند (دیویس، ۱۹۹۷). بنابراین، برخی از ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی به احتمال زیاد بسیار پیش از ظهور انسان، طب مدرن، و استفاده از آنتی‌بیوتیک ها در کشاورزی بوجود آمده‌اند.
۶-۲-۲- مکانیسم های مقاومت به آنتی بیوتیک
دو مورد از رایجترین معیارهای مورد استفاده برای توصیف مقاومت آنتی بیوتیکی بر اساس فاکتورهای میکروبیولوژیکی (مقاومت آزمایشگاهی) و بالینی (مقاومت در بدن) استوار است (گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶). برای تعریف میکروبیولوژیکی، سویه‌ای به عنوان مقاوم تعریف شده که دیگر توسط حداقل غلظت مهاری آن آنتی بیوتیک[۱۶] که مانع از رشد سویه های معمولی آن گونه میشود، مهار نشود (گرین وود، ۱۹۹۵) با این حال، برای تعاریف بالینی، سویه‌ای به عنوان مقاوم تعریف میشود که تحت درمان دارویی، زنده باقی بماند (گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶). اما به طور معمول مراد از مقاومت نوع آزمایشگاهی آن بوده و ملاک ما هم در این پایان نامه بر مبنای آن است زیرا نوع بالینی آن به فاکتورهای متعددی از قبیل دوزاژ، نحوه تجویز، توزیع بافتی دارو و وضعیت ایمنی بیمار بستگی دارد.
سلول های باکتریایی با بهره گرفتن از مکانیسم های مختلفی در برابر اثرات آنتی بیوتیک ها مقاومت می‌کنند. مقاومت به داروهای ضد میکروبی در باکتری ها می تواند ذاتی به دلیل مکانیسم عمل دارو یا اکتسابی باشد. حالت اکتسابی نوعی است که می تواند انتشار یابد و باعث افزایش مشکلاتی شود که امروزه جامعه پزشکی با آن مواجه است (رایس و بونومو، ۲۰۰۵).
رایجترین مکانیسم های مقاومت عبارتند از:
۱-۶-۲-۲- تغییر یا جایگزینی اهداف دارو
با تغییر یا جایگزینی گیرنده هدف، آنتی بیوتیک دیگر متصل نمی شود و به همین دلیل اثر مد نظر را ندارد. این روش تقریبا برای مکانیسم های مقاومت تمام گروه های آنتی بیوتیکی مرتبط است. تاکنون آشکار شده است که این راه برای مقاومت به پنی سیلین، گلیکولیپیدها، ماکرولیدها، لینکوزآمیدها، واسترپتوگرامین‌ها (MLS) در باکتریهای گرم مثبت، و برای مقاومت به کینولون ها در هر دوگروه باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، حائز اهمیت است. متیلاسیون هدف دارو، جهش ریبوزوم (برای مقاومت در برابر آمینوگلیکوزید و MLS) و جهش ژن مربوط به آنزیم باکتریایی که دارو آنرا هدف قرار داده است در مورد مقاومت به کینولون نمونه هایی از تغییر هدف هستند. مقاومت به گلیکوپپتیدها در انتروکوکسی‌ها و مقاومت به متی‌سیلین در استافیلوکوکوس اورئوس نمونه‌هایی از جایگزینی هدف دارو با یک ترکیب با میل ترکیبی کمتر است (گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶)
۲-۶-۲-۲-غیرفعالسازی آنزیمی دارو
غیر فعال سازی آنزیمی مکانیزم اصلی است که باکتری برای فرار از اثر بتا-لاکتام‌ها، آمینوگلیکوزیدها، و فنیکل‌ها استفاده می‌کند. اگرچه شایع نیست، اما معلوم شده که این مکانیسم‌ها در مقاومت به تتراسایکلین، MLS و فسفومایسین دخیل هستند. آنزیم ها می‌توانند جایگاه فعال دارو را توسط شکستن مولکول دارو یا اضافه کردن گروه های شیمیایی که از از اتصال دارو به سایت هدف خود جلوگیری می‌کند و سبب از دست دادن توانایی آنتی‌باکتریال دارو میشود، تغییر دهند. مهم ترین آنزیم‌های غیر فعال کننده داروها عبارتند از: بتا-لاکتاماز و آنزیم‌های تغییردهنده‌ی آمینوگلیکوزیدها[۱۷]. بتا-لاکتاماز، آنتی بیوتیک های بتالاکتام را قبل از رسیدن به محل هدف در باکتری از بین می‌برند و از اتصال آن به سایت هدف جلوگیری می‌کنند. آنزیم‌های تغییردهنده‌ی آمینوگلیکوزیدها عمل خود را توسط تسریع انتقال گروه استیل به گروه های آمین یا گروه‌های فسفریل یا نوکلئوتید‌ها به گروه‌های آمین یا هیدروکسیل در مولکول آمینوگلیکوزید انجام می‌دهند که منجر به اتصال ضعیف این دارو به ریبوزوم می‌شوند (ساندایاناکا و پراشاد، ۲۰۰۲؛ بابیک و همکاران،۲۰۰۶؛ گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶).
۳-۶-۲-۲- پمپ‌های خارج کننده دارو از سلول[۱۸]
سیستم‌های خروج دارو از سلول با پمپاژ فعال مولکول های آنتی‌بیوتیک به خارج، از تجمع داخل سلولی آن جلوگیری می‌کنند، زیرا این تجمع برای اعمال فعالیت های کشنده آنتی‌بیوتیک ضروری است. پمپ‌های خارج کننده دارو از سلول مکانیسم های وابسته به انرژی هستند. این پمپ ها ممکن است برای یک سوبسترا اختصاصی باشند (پمپ های مقاومت مخصوص دارو[۱۹]) و یا ممکن است طیف وسیعی از ترکیبات ساختاری غیر مشابه، از جمله آنتیبیوتیکهای چندین کلاس و دسته را انتقال دهند که موجب مقاومت دارویی چندگانه شود (پمپ های مقاومت دارویی چندگانه). پمپ های مقاومت مخصوص دارو مهمترین مکانیزم مقاومت به تتراسایکلین هستند. این پمپ ها به طور کلی سطح بالایی از مقاومت را ایجاد می‌کنند و عمدتا با عناصر ژنتیکی متحرک[۲۰] در ارتباط هستند. پمپ های مقاومت دارویی چندگانه ممکن است چند سوبسترا داشته باشد، با این حال این پمپ ها به طور کلی سطح پایینی از مقاومت را ایجاد کرده و معمولا بر روی کروموزوم کد گذاری شده‌اند (کوهلر و همکاران، ۱۹۹۹؛ وبر و پیداک، ۲۰۰۳؛ گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶)
۴-۶-۲-۲- کاهش جذب دارو[۲۱]
کاهش جذب دارو یکی دیگر از مکانیسم های باکتریها است که به منظور کاهش غلظت داروهای در حال تجمع در سلول، استفاده می‌کنند. این امر ممکن است از طریق مکانیسم‌های متعددی از جمله کاهش نفوذپذیری غشای خارجی رخ دهد، همانطور که در سودوموناس آئروژینوزا و E. coli O157:H7 ، جهش پورین[۲۲](لوله‌های پروتئینی توخالی بتا که از دیواره سلولی عبور کرده و به عنوان یک روزنه عمل می‌کنند که مولکول‌ها از طریق آن می‌توانند انتشار یابند) منجر به از دست دادن، اندازه کوچک، و یا کاهش بیان پروتئین‌های پورین میشود، ویا کاهش بیان پورین OmpF که نشان داده شده است سبب افزایش مقاومت باکتری E. coli به کینولون ها، بتا-لاکتام‌ها، تتراسایکلین و کلرامفنیکل میشود. فقدان یک شیب پتانسیل الکتریکی که برای بردن داروها از یک سوی به سوی دیگر غشاء باکتری لازم است، همانطور که در مورد مقاومت در برابر آمینوگلیکوزیدها هم اختلال در این امر سبب کاهش جذب دارو توسط باکتری ها میشود (میتس و همکاران، ۱۹۸۲؛ آیزنبرگ و همکاران، ۱۹۸۴؛ گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶).
۵-۶-۲-۲- حفاظت از هدف[۲۳]
گزارش شده است که حفاظت از هدف در مقاومت به تتراسایکلین‌ها و کینولون ها نقش دارد. مقاومت در برابر تتراسایکلین ها توسط این مکانیسم از حضور پروتئین‌های حفاظت ریبوزومی[۲۴] ناشی میشود. حداقل هشت پروتئین حفاظت ریبوزومی یافت شده است که با مقاومت در برابر تتراسایکلین مرتبط بوده‌اند. در میان آنها، Tet(M) و Tet(O) شایع ترین هستند و به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته‌اند. حضور یک پروتئین حفاظت کننده از DNA gyrase در مقاومت در برابر کینولون‌ها در انتروباکتریاسه گزارش شده شده است (کانل و همکاران، ۲۰۰۳؛ ترن و همکاران، ۲۰۰۵؛ گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶؛ گوئیمند و همکاران، ۲۰۰۶؛ کوبایاشی و همکاران، ۲۰۰۷).
۶-۶-۲-۲- بدام انداختن دارو
باکتری می تواند دارو را با تولید بیش از حد هدف آن، یا مولکول های دیگری که میل ترکیبی بالایی برای داروی مورد نظر دارد آنرا به دام اندازد. تولید بیش از حد اهداف سولفونامیدها، دی‌آمینوپیریمیدین‌ها، در چندین گونه باکتری گزارش شده است. نشان داده شده است که یک جهش، منجر به دیواره سلولی ضخیم تر با محل‌های اتصال بسیار برای وانکومایسین، سبب به دام انداختن مولکول های آنتی بیوتیک شده که بدان وسیله تعداد مولکول های وانکومایسین را که به غشای سیتوپلاسمی (جایی که اهداف ترانسگلیکوزیلاز در آن قرار دارد) می‌رسند کاهش می‌دهد (کوی و همکاران، ۲۰۰۳؛ باگسیجیل و همکاران، ۲۰۰۷).
تصویر ۱-۱ مکانیزم های توسعه مقاومت به آنتی بیوتیک A) تغییر هدف B) حفاظت از هدف C) بدام انداختن دارو D) غیرفعالسازی آنزیمی دارو E) کاهش جذب دارو F) پمپ‌های خارج کننده دارو از سلول (گوارداباسی و کوروالین، ۲۰۰۶)
۷-۲-۲- انتشار مقاومت به آنتی بیوتیک
بسیاری از مکانیزم های مختلف مقاومت به آنتی بیوتیکها بین باکتری ها به طریقه‌های گوناگون منتشر می شوند که بسته به آن که آیا آن مکانیزم‌ها در DNA کروموزومی و یا خارج کروموزومی واقع شده‌اند عبارتند از:
۱-۷-۲-۲- وراثت عمودی[۲۵]
مقاومت ناشی از جهش های کروموزومی بوسیله‌ی تکرار در تقسیم سلولی. همیشه به صورت عمودی به نسل بعد منتقل میشود. همچنین مکانیسم های دیگری نیز مانند پروتئین های القایی[۲۶] می تواند توسط ژنهای‌کروموزومی رمزگردانی شده و به این ترتیب بوسیله‌ی وراثت عمودی در میان باکتری ها منتقل شود (رایس و بونومو، ۲۰۰۵).
۲-۷-۲-۲- انتقال افقی[۲۷]
انتقال افقی مقاومت تا حد زیادی بین باکتری های یک گونه یا گونه های مختلف رخ می‌دهد. اغلب بیش از یک ژن مقاومت روی یک عنصر قابل انتقال واقع شده و بنابراین مقاومت به بسیاری از آنتی بیوتیک های مختلف می تواند از لحاظ ژنتیکی مرتبط باشد. این به این معنی است که استفاده از یکی از این آنتی بیوتیک ها می تواند سبب انتخاب همزمان مقاومت به بسیاری از انواع دیگر از آنتی بیوتیکها شود. هنگامی که این عناصر بین باکتری های منتشر میشود، انتشار مقاومت در برابر بسیاری از انواع آنتی بیوتیک ها به صورت همزمان رخ می‌دهد.
۸-۲-۲- مکانیسم‌های دخیل در انتقال افقی
کسب ژنهای مقاومت‌های به روش انتقال افقی عمدتا از طریق سه مکانیزم مختلف رخ می‌دهد که شامل : ترانسفورماسیون، ترانسداکسیون و کنژوگاسیون است.
ترانسفورماسیون به معنای جذب DNA آزاد از سلولهای باکتری لیز شده در محیط مجاور آن میباشد. هنگامی که عوامل تعیین کننده مقاومت با این مکانیسم گرفته شد آنها می‌توانند بوسیله‌ی نوترکیبی هومولوگ وارد کروموزوم باکتریایی شوند که منجر به آرایش موزاییکی جدید ژنها می شود.
ترانسداکسیون، انتقال DNA باکتریایی با واسطه باکتریوفاژ است و معمولا برای انتشار موثر و کارآمد ژن مقاومت چندان مهم و مطرح نمی‌باشد. فاژهایی که وارد کروموزوم باکتریایی شده‌اند، زمان خروج و بسته‌بندی در کپسول می‌توانند یک بخش از DNAباکتری راکه در مجاور آنها بوده است، با خود حمل کرده و متعاقب آن به سلول باکتری بعدی که توسط ویروس (فاژ) آلوده شده، منتقل می شود. کپسول همچنین می تواند شامل DNA نامربوط مانند پلاسمیدها کوچک و یا تکه های DNA باشد و سبب گسترش بیشتر آنها شود، این سناریویی است که برای فاژهایی که وارد DNA باکتری میزبان نشده‌اند صادق میباشد.
کنژوگاسیون مهم ترین مکانیسم برای انتقال افقی محسوب میشود، که تبادل DNA زمانی رخ می‌دهد که سلول های دهنده و گیرنده در تماس مستقیم با یکدیگر باشند (رایس و بونومو، ۲۰۰۵).
تصویر ۲-۱ سه مکانیسم اصلی که توسط آن ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی به صورت افقی در میان باکتری ها منتقل می‌شوند. A) ترانسداکسیون B) ترانسفورماسیون C) کنژوگاسیون (لیامتانگ، ۲۰۰۸)
۹-۲-۲- عناصر دخیل در انتقال افقی ژن های مقاومت
پلاسمیدها، ترانسپوزونها، اینتگرونها / کاستهای ژنی، و جزایر ژنومی کروموزومی، نقش مهمی در انتقال افقی ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی بازی می‌کنند (شوارتز و چاسلوس-دانکلا، ۲۰۰۱). این چهار نوع عنصر از DNA دو رشته تشکیل شده‌اند اما بطورواضحی در اندازه، ساختار، خواص بیولوژیکی و همچنین مکانیسم های گسترش، تفاوت دارند (شوارتز و همکاران، ۲۰۰۶)
۱-۹-۲-۲- پلاسمیدها
ناقل رایج برای انتقال ژنهای مقاومت است، پلاسمیدها خارج کروموزومی، و غالبا مولکولهای DNA حلقوی هستند. پلاسمیدها حاوی ژن های هستند که برای بقای باکتری ضروری نیست، اما اغلب برای باکتری ها مفید است برای مثال حاوی ژنهای مقاومت و ژنهایی که عملکرد متابولیکی و عوامل حدت را رمزگردانی می‌کنند، هستند. این عناصر مکانیسم های تکثیر خود را حمل می‌کنند و بنابراین می توانند به تعداد زیاد در سلول باکتری وجود داشته باشند. پلاسمیدهای کوچک، با اندازه‌‌ی حدود ۳ کیلوباز شناخته شده‌اند که در بیش از ۲۰ نسخه در یک سلول وجود دارند و در نتیجه در سویه باکتریایی میزبان بسیار پایدار هستند. از سوی دیگر پلاسمیدهای بزرگ که اندازه‌ای تا ۱۸۰ کیلو باز دارند، غالبا تنها در یک نسخه وجود دارند اما اغلب حامل ژنهای خاص برای پارتیشن بندی خود در سلولهای در حال تقسیم هستند تا اطمینان حاصل شود که هر سلول جدید یک کپی از پلاسمید را دارد. باکتری ها گاهی اوقات چندین پلاسمید مختلف حمل می‌کنند که می تواند شامل ژنهای مقاومت های مختلف بسیاری باشد. همه انواع پلاسمیدها نمی‌توانند در یک سلول باکتریایی همزیستی داشته باشند، این امر سبب تقسیم پلاسمیدها به گروه های ناسازگار میشود. مکانیسم اصلی انتقال پلاسمیدها کونژوگاسیون است. حداقل ۳۳ کیلوباز برای انتقال ژنها بواسطه‌ی کونژوگاسیون نیاز است. محدوده‌ی پلاسمیدهای گوناگون میزبان متنوع و بی‌ثبات است، در حالی که برخی فقط دریک گونه انتشار می‌یابند بقیه می‌توانند به طیف گسترده ای از میزبان ها منتقل شده و در نتیجه فاکتورهای مقاومت را بین گونه های مختلف مهم، گسترش دهند (رایس و همکاران، ۲۰۰۳؛ رایس و بونومو، ۲۰۰۵)
۲-۹-۲-۲- ترانسپوزونها
علاوه بر فاکتورهای مقاومت یا ژنهای دیگر، ترانسپوزونها عناصری هستند که ژنهایی را حمل می‌کنند که سبب جابجایی[۲۸] خودشان، مستقل از نوترکیبی میزبان، میشود. ورود ترانسپوزونها گاهی اوقات، مثلا در مورد Tn7، خاص یک جایگاه[۲۹] است اما غالبا در طیف گسترده ای از زمینه ها، هم در پلاسمید و هم درDNA کروموزومی وارد می‌شوند. از آنجا که ترانسپوزونها سیستم های تکثیر ندارند، آنها باید با کروموزوم یا پلاسمیدها ادغام شوند تا ثبات خود را حفظ کنند. ترانسپوزونها می‌توانند در ساختارها و اندازه های مختلف از کمتر از ۱ کیلوباز تا ۶۰ کیلوباز متفاوت باشند. کوچکترین نوع آنها توالی ورود[۳۰] (IS) است که معمولا فقط حامل ژنهای ترانسپوزاز[۳۱] است که محصولاتشان واسطه‌ی جابجایی عناصر ژنتیکی هستند. ورود ژنهای اضافی، مانند ژنهای سم، و غالبا ژنهای مقاومت آنتی بیوتیکی، ترانسپوزونها را بزرگتر می‌کند (کیز و همکاران، ۲۰۰۸). ترانسپوزونهای مرکب[۳۲]، مانند Tn9، Tn10، و Tn5706، معمولاحاوی یک یا چند ژن مرکزی مقاومت آنتی بیوتیکی و توالی ورود (IS) در دو انتهای خود هستند. ترانسپوزونهای پیچیده، مانند Tn1721، معمولا توسط توالی های تکراری معکوس انتهایی[۳۳] و نیز گاهی اوقات توالی های تکراری داخلی مشخص می‌شوند که سبب جدا کردن بخش حامل ژنهای مقاومت از قسمت حامل ژنهای ترانسپوزاز میشود. همانند پلاسمیدها، ترانسپوزونهای کونژوگاتیو و غیرکونژوگاتیو نیز وجود دارند. ترانسپوزونهای کونژوگاتیو به عنوان مثال، Tn916 ، نه تنها در میان گونه‌های باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، بلکه بین هر دو گروه منتقل میشود. ژن مقاومت به تتراسیکلین، (tetM)، روی یک ترانسپوزون کونژوگاتیو واقع شده و می تواند در میان چندین جنس از باکتری ها مانند: گونه‌های انتروکوکوس، استافیلوکوکوس، استرپتوکوکوس، اکتینومایسس، بیفیدوباکتریوم، کمپیلوباکتر، قارچ Fusarium nucleatum، گونه های هموفیلوس و نایسریا انتقال یابد (سال‌یرز و شومیکر، ۲۰۰۶)
۳-۹-۲-۲- اینتگرونها
۱۰-۲- ساختار و ویژگیهای اینتگرونها
اینتگرونها عناصر ژنتیکی هستند که یک ابزار کارآمد برای گرفتن، بیان و تبادل ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری های گرم منفی را فراهم می‌کنند. اجزای ضروری یک اینتگرون شامل: ژن intI، که یک آنزیم ریکامبیناز با جایگاه خاص شناسایی را رمزگردانی می‌کند و یک سایت نوترکیبی attI، هستند. این سایت نوترکیبی توسط اینتگراز تشخیص داده میشود و یک سایت پذیرنده برای کاستهای ژنی دریافتی است. علاوه بر این، یک پروموتور، Pc، سبب رونویسی از کاستهای ژنی وارد شده میشود (تصویر ۳-۱). کاست های ژنی شامل یک چارچوب خواندن باز (ORF[34]) برای ژنی که مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می‌کند و همچنین یک سایت نوترکیبی که عنصر ۵۹-بازی
(۵۹- be)[35] نامگذاری شده، میباشند. این عناصر ۵۹ بازی، توالی‌های تکراری معکوسی هستند که در انتهای ’۳ چارچوب خواندن باز، یافت می‌شوند وتوسط اینتگراز تشخیص داده می‌شوند (مک، ۲۰۰۹)
تصویر۳-۱) ساختمان کلی یک اینتگرون (مک، ۲۰۰۹)
دوگروه عمده از اینتگرونها وجود دارند : انواع کروموزومی Chromosomal integrons (CIs )وانواع متحرک Mobile integrons (MIs ). CIs بر روی کروموزوم صدها گونه از باکتری هاوجود دارند. در طی تحقیقی نشان داده شدکه۱۷ % ژنوم باکتری های تعیین توالی شده آرایش ژنتیکی CIs را نشان داده اند (کمبری وهمکاران، ۲۰۱۰). CIs . اغلب درباکتری های اکوسیستم های دریایی وخاکی مثل گونه های گزانتوموناس و ویبریو شناسایی شده اند. نام دیگر اینتگرونهای کروموزومی super integrons (SIs )می باشد زیرا آنها می توانند تا ۲۰۰ کاست ژنی راحمل کنند که عملکرد محصول پروتئینی اغلب آنها ناشناخته است (ناس و همکاران، ۲۰۰۱).
کاست های ژنی که تا امروز در MIs شناسایی شده اند معمولا فاکتورهای مقاومت آنتی بیوتیکی را رمزگردانی می کنند بنابراین به این اینتگرونها resistance integrons (RIs )یاmultidrug resistance integrons (MRIs )گویند (استالدر و همکاران، ۲۰۱۲).
تا کنون کلاسهای متنوعی از اینتگرونها (MIs) شناسایی شده که سه گروه مجزا از آنها در ایجاد مقاومت آنتی بیوتیکی درگیر هستند، که شامل کلاس۱، کلاس۲، و کلاس۳ میباشند. کلاسهای گوناگون اینتگرونها بواسطه‌ی توالی ژن intI، که آنزیم اینتگراز را رمزگردانی می‌کند از هم تمایز داده می‌شوند.
۱-۱۰-۲- کلاس ۱ اینتگرونها
کلاس ۱ اینتگرونها برای اولین بار توسط استوکس و هال در سال ۱۹۸۹ شرح داده شد (استوکس و هال، ۱۹۸۴). آنها هنوز هم شایعترین و گسترده‌ترین طبقه که مورد مطالعه قرار گرفته باقی مانده‌اند. اکثریت شناخته شده‌ی کاستهای ژنی مربوط به مقاومت به آنتی بیوتیکها، که تا کنون شرح داده شده متعلق به کلاس ۱ اینتگرون‌هاست، که خصوصیت ویژه‌ی آنها حضور قسمت ثابت انتهایی ۵’ (۵’-CS) است. همانطور که قبلا اشاره شد ۵’-CS متشکل از سه مولفه اساسی از اینتگرون کلاس۱ است که که عبارتند از ژن intI1، یک سایت اتصال attI1 و پروموتور Pc (تصویر۴-۱)
تصویر۴-۱: ساختمان کلی کلاس۱ اینتگرونها (مک، ۲۰۰۹)
ویژگی دیگر اکثر اینتگرونهای کلاس۱ وجود بخش ثابت انتهای۳’ (۳’-CS) است. ۳’-CS به طور معمول ۲۳۸۴ جفت باز طول دارد و چهار ژن رمز گردان (ORFs) را کد می‌کند (براون و همکاران، ۱۹۹۶). اولین ژن رمزگردان ژن qacE∆۱است که نشان دهنده نسخه‌ی کوتاه شده کاست ژنی qacE است که مقاومت در برابر ترکیبات چهارتایی آمونیوم را کد می‌کند (تصویر۴-۱). این کوتاه شدگی ممکن است به علت قرار گرفتن فاکتور مقاومت سولفونامیدی sul1 در انتهای ۳’ آن باشد که منجر به از بین بردن عنصر ۵۹-بازی (۵۹- be) ژن qacE و برخی از توالی‌های رمزگردان آن شده است (پالسن و همکاران، ۱۹۹۳). سومین ژن رمزگردان، ORF5 است که هیچ عملکرد شناخته شده‌ای ندارد اما برخی شباهت‌ها به پورومایسین استیل ترانسفراز[۳۶] نشان می‌دهد (تصویر۴-۱) (بیسونت و روی، ۱۹۹۲).چهارمین و آخرین ژن رمزگردان، ژن ORF6 است که هیچ عملکرد بیولوژیکی شناخته شده‌ای ندارد (تصویر۴-۱). انواعی از اینتگرونهای کلاس۱ یافت شده‌اند که فاقد انتهای ثابت ۳’ هستند، یکی از این نمونهها اینتگرون کلاس۱ است که در ترانسپوزون Tn402 یافت شده است که حاوی کاست کامل ژن qacE است، اما فاقد ژن sul1 و دو ژن رمز گردان دیگر میباشد (تصویر۵-۱) (راداشتروم و همکاران، ۱۹۹۴؛ هولودای و همکاران، ۱۹۹۵). این ترانسپوزون همچنین شامل یک واحد ژن جابجایی[۳۷] (tni module) که حاوی ژنهای tniA, tniB، tniQ و tniR (که به عنوان tniC شناخته می شود) است، میباشد (هولودای و همکاران، ۱۹۹۵)
همچنین این ترانسپوزون حاوی توالی‌های تکرار شونده معکوس[۳۸] (IRs) است که در طرفین اینتگرون و واحدهای جابجایی قرار دارد (تصویر۵-۱). بنابراین، اینتگرون کلاس۱ که در داخل Tn402 قرار دارد، می‌تواند از طریق مکانیسم transposition به صورت افقی منتقل شود. اینطور فرض شده است که Tn402 جد امروزی اینتگرونهای کلاس۱ میباشد (پارتریج و همکاران، ۲۰۰۱الف؛ پارتریج و همکاران، ۲۰۰۱ب).
تصویر ۵-۱: ساختار کلاس ۱ اینتگرون یافت شده در Tn402 (مک، ۲۰۰۹)
۲-۱۰-۲- کلاس ۲ اینتگرونها
گروه دوم از اینتگرونها نیز درون ترانسپوزونها (مثلا Tn7و ترانسپوزونهای مربوطه) یافت شده‌اند (تصویر۶-۱) (تیتز و همکاران، ۱۹۸۷؛ یانگ و همکاران، ۱۹۹۴؛ هانسون و همکاران، ۲۰۰۲). تفاوت اساسی و ویژگی کلیدی توصیف کننده کلاس۲ اینتگرونها این است که ژن intI2 توسط یک کدون پایان ابتدایی متوقف میشود که منجر به تولید پروتئین غیر فعال ۱۷۸ اسید آمینه‌ای میشود. با این حال، جهش این کدون پایان منجر به بازیابی فعالیت اینتگراز میشود (هانسون و همکاران، ۲۰۰۲). برای مثال اخیرا یک اینتگراز کلاس۲ فعال توسط مارکز و همکاران از سویه‌ای از ای‌کلای گزارش شد که با اینتگراز ۲ موجود در Tn7 شش نوکلئوتید تفاوت داشت که شامل کدون پایان هم بود و این اینتگرون شامل دو کاست ژنی برای مقاومت به تری متوپریم و لیپوپروتئین پپتیداز، بود.
تصویر۶-۱: ساختار اینتگرون کلاس۲ موجود در Tn7 (مک، ۲۰۰۹)
به طور کلی ۵ اینتگرون کلاس ۲ مشخص شده است. که هر پنج مورد حاوی، کاستهای ژنی sat که مقاومت به استرپتوتریسین و aadA1 که مقاومت به استرپتومایسین و اسپکتینومایسین را رمزگردانی می‌کنند، هستند (تصویر۶-۱). اینتگرون مربوط بهTn7، همچنین حاوی کاست ژنی dfrA1 در مجاورت سایت attI2 میباشد که سبب مقاومت به تریمتوپریم میشود. همچنین در این اینتگرون کاست ژنی چهارمی به نام orfX وجود داردکه یک پروتئین با عملکرد ناشناخته را رمزگردانی می‌کند. این ژن orfX فاقد عنصر ۵۹ بازی است اما از لحاظ عملکردی نقش سایت نوترکیبی دارد (هانسون و همکاران، ۱۹۹۷)
تفاوتهای مختصر در کاستهای ژنی اینتگرونهای کلاس۲ بیانگر میزانی از جابجایی کاستهای ژنی است که کاملا معلوم نیست به علت فعالیت نوترکیبی سایر اینتگرازها (کلاس ۱و۳) باشد یا به علت سرکوب گاه به گاه کدون پایان باشد که منجر به بازیابی فعالیت نوترکیبی اینتگراز۲ شده است (میزل، ۲۰۰۶).
۳-۱۰-۲- کلاس ۳ اینتگرونها
اینتگرونهای کلاس ۳ دخیل در مقاومت آنتی‌بیوتیکی تنها در ژاپن و اخیرا در پرتقال و کانادا یافت شده‌اند. دو کاست ژنی در آرایه‌ی[۳۹] ژنی این کلاس وجود دارد: blaIMP-1، که متالو-بتاکلاکتاماز رارمزگردانی می‌کند و aacA4، که مقاومت به آمینوگلیکوزیدها را ایجاد می‌کند (تصویر۷-۱). کاست ژنی blaIMP-1، سابقا در کلاس۱ شناسایی شده و به طور گسترده درآنها وجود دارد (میزل، ۲۰۰۶)
تصویر۷-۱: ساختار اولین اینتگرون کلاس ۳ از ژاپن (مک،۲۰۰۹)
۴-۱۰-۲- سوپر اینتگرونهای کروموزومی یا کلاس ۴
سوپر اینتگرونها برای اولین بار در ژنوم ویبریوکلرا (عامل وبا) توضیح داده شد. علت نامگذاری آنها آن است ساختار آنها ۱۲۶ کیلوباز طول دارد و حداقل ۱۷۸ کاست ژنی دارند (میزل و همکاران، ۱۹۹۸). اما این کاستهای ژنی به نظر نمی‌رسد هیچ مقاومت آنتی‌بیوتیکی را رمزگردانی کنند بلکه در اعمال تطبیقی از قبیل متابولیسم و تغییرات DNA شرکت می‌کنند گرچه هنوز مجموعه اعمال آنهابه طور کامل شناخته نشده است (میزل، ۲۰۰۶).
این کلاس واجد چندین ویژگی است: اولا باید ۲۰ کاست ژنی داشته باشد، ثانیا باید عناصر ۵۹-بازی انتهای ۳’ کاستهای ژنی بالغ بر ۸۰ درصد تشابه داشته باشند، ثالثا این کلاس نباید با هیج نوع عنصر ژنتیکی متحرک مرتبط باشد.
۱۱-۲-کاست ژنی
۱-۱۱-۲- تعریف
کاستهای ژنی ساختارهایی هستند که حاوی ژن رمزگردان مقاومت آنتی‌بیوتیکی و سایت نوترکیبی ۵۹-بازی هستند. این کاستها فاقد پروموتور هستند و بنابراین برای بیان باید وارد اینتگرونها شوند. بیش از ۱۳۰ کاست ژنی در ارتباط با مقاومت آنتی‌بیوتیکی شناخته شده که سبب مقاومت تقریبا به تمام دسته‌ه ای آنتی‌بیوتیکی می‌شوند[۴۰] (پالکی و همکاران، ۲۰۰۷). بیشتر کاستهای ژنی اینتگرونهای کلاس ۱و۲و۳ واسطه‌ی مقاومت به ترکیبات ضدمیکروبی هستند. که شاید یک دلیلش آن باشد که اکثر نمونه های مطالعه شده باکتریهای مقاوم، گرفته شده از موارد بالینی یامحیط بوده‌اند.
کاستهای ژنی به دو شکل یافت می‌شوند:
فرم حلقوی، آزاد یا غیر تکثیر شونده
فرم خطی، وقتی که وارد پلاسمید، ترانسپوزون یا کروموزوم میشود (تصویر۸-۱)
تصویر۸-۱: ساختار کاستها (B) ، همراه اینتگرون (رکیا و هال، ۱۹۹۵الف؛ پارتریج و همکاران، ۲۰۰۹)
طول کاستهای ژنی معمولا بدلیل تفاوت در طول ناحیه‌ی رمزگردان و نیز سایت نوترکیبی ۵۹-بازی، متفاوت است (رکیا و هال، ۱۹۹۵الف). علیرغم اختلاف طول کاستهای ژنی یکسری ویژگیهای مشترک دارند که در ذیل به آنها اشاره شده است. مرزهای کاستها توسط دو توالی به نامهای Core site (CS) و Inverse core site (ICS) مشخص شده‌اند. این توالی‌های معکوس متعلق به سایت نوترکیبی ۵۹-بازی یا همان attC میباشد. حضور این توالی‌ها اولین بار در ژن aadB (کدکننده مقاومت به جنتامایسین) که وارد پلاسمید مقاومت چندگانه دارویی (MDR) pGDO100 شده بود، تشخیص داده شد (کامرون و همکاران، ۱۹۸۶). در مطالعه‌ای که استوکس و همکاران در سال ۱۹۸۹ در آن تمام کاستهای شناخته شده تا آن زمان را بررسی کردند مشخص شد که توالی ثابت GTTRRRY همواره در محل اتصال۵’-CS کاست ژنی به۳’-CS اینتگرون وجود دارد. بنابراین اینطور نتیجه‌گیری شد که کاست ژنی توالی TTRRRY را از کاست ماقبل خود و تنها G را از Core site خود گرفته است (تصویر۸-۱) (استوکس و هال، ۱۹۸۹).
تصویر۸-۱:ساختار شماتیک کاست وارد شده به اینتگرون (R نشان دهنده‌ی بازهای پورین وY
نشان دهنده‌ی بازهای پیریمیدین است) (مک، ۲۰۰۹)
اینتگراز
ژن intI، آنزیم اینتگراز که متعلق به خانواده تیروزین ریکامبیناز است را رمزگردانی می‌کند (اسپوزیتو و اسکوکا، ۱۹۹۷). آنزیم اینتگراز اینتگرونهای کلاس مختلف از نظر طول مشابه‌اند اما تنها ۴۰-۶۰ ٪ از محتوای اسید آمینه‌ی آنها یکسان است. اینتگراز کلاس۲ و اینتگراز کلاس۳ به ترتیب ۴۶ % و ۵۹ % با کلاس۱ همسانی و انطباق دارند (کالیس و همکاران، ۲۰۰۲ب).
۲-۱۱-۲- انتقال کاستهای ژنی
آنزیم اینتگراز برداشتن (خروج) و ادغام ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک در اینتگرون را توسط یک سیستم نوترکیبی اختصاصی جایگاه[۴۱] کاتالیز می‌کند. این واکنش توسط اینتگراز از تعامل با دو سایت مختلف نوترکیبی،شامل: سایت اتصال اینتگرون (attI) در انتهای ثابت ۵’ اینتگرون، و سایت اتصال کاست (attC) یا عنصر ۵۹ بازی (۵۹-be) کاستهای ژنی ، حاصل میشود (کریستینا و همکاران، ۱۹۹۸؛ پارتریج و همکاران، ۲۰۰۰؛ مسیه و روی، ۲۰۰۱). اینتگراز DNA دو رشته‌ای را در هر دو سایت attI و attC بین باز G و اولینT درداخل یک توالی ۷ جفت بازی، می‌شکند (GTTRRRY، این توالی به عنوان core siteشناخته میشود) (استوکس و هال، ۱۹۸۹). اکثر کاستهای ژنی مقاومت به آنتی‌بیوتیک به عنوان عناصر بدون پروموتور به درون اینتگرونها وارد می‌شوند، بنابراین بیان ژنهای واقع در کاستها وابسته به پروموتور واقع در پایین دست[۴۲] سایت attI است. در کلاس۱ اینتگرونها بخش ثابت انتهای ۵’، شامل ۲ پروموتور (راه انداز) بالقوه، P1 (که با نام PANT هم خوانده میشود) و P2 میباشد. این پروموتورها از لحاظ قدرت متفاوت‌اند، به طوری که P1 بیست برابر قوی‌تر است و P2 ضعیف‌تر میباشد یا اغلب غیرفعال است. حداقل ۵ توالی متفاوت P1 و دو توالی متفاوت P2 شناخته شده است (استوکس و هال، ۱۹۸۹؛ هال و استوکس، ۱۹۹۳؛ لیوک و همکاران، ۱۹۹۴). علاوه بر نوترکیبی بین دو سایت attI و attC (عنصر ۵۹ بازی) ، ورود کاست ژنی بین دو سایت ۵۹-بازی (attC) هم می‌تواند رخ دهد اما به میزان واحتمال کمتر (کریستینا و همکاران، ۱۹۹۸؛ گراول و همکاران، ۱۹۹۸؛ کالیس و همکاران، ۲۰۰۲الف). خروج یک کاست ژنی هم نیازمند عملکرد نوترکیبی اینتگراز بین سایت attI و سایت attCمربوط به آن کاست و یا بین دوسایت attC(وقتی کاست ژنی مجاور سایت attI نیست) میباشد (کالیس و هال، ۱۹۹۲الف؛ کالیس و همکاران، ۱۹۹۳). خروج و ورود مجدد کاستهای ژنی مسئول ایجاد بازآرایی در ترتیب وچیدمان اینتگرونها است (تصویر۹-۱) (کالیس و هال، ۱۹۹۲ب).
فاصله‌ی کاستهای ژنی از پروموتور بر سطح بیان آنها تاثیر می‌گذارد، طوری که هر چه کاستهای ژنی از پروموتور دورتر باشند، میزان کمتری مولکول mRNA تولید و سطوح کمتری از مقاومت را ایجاد می‌کنند که این به این علت است که عناصر ۵۹ بازی انتهای۳’ کاستهای ژنی به عنوان خاتمه‌دهنده‌ی رونویسی عمل می‌کنند (کالیس و هال، ۱۹۹۲ب).
تصویر۹-۱: مکانیسم ورود و بیان کاستهای ژنی توسط اینتگرون کلاس۱
(رو-مگنوس و میزل، ۱۹۹۹؛ هارباتل و همکاران، ۲۰۰۶)
۱۲-۲- اپیدمیولوژی اینتگرونها و مروری بر شناسایی اینتگرونها در ماکیان
انواع زیادی از باکتریها در حیوانات گوناگون رایج هستند. . اشریشیا‌کولی، کلستریدیوم، استرپتوکوک، و لاکتوباسیلوس معمولا در روده گاو، گوسفند، خوک، ماکیان، سگ، گربه، و انسان وجود دارد. علاوه بر این، سالمونلا، کامپیلوباکتر، یرسینیا، شیگلا، ویبریو، و استافیلوکوکوس نیز به صورت گذرا یا فلور طبیعی وجود دارند . نقش فلور نرمال بسیار مهم است، زیرا با ایجاد رقابت برای جذب مواد واتصال به روده و اشغال جایگاههای اتصال مانع کلونیزه شدن پاتوژنها میشود و نیز با تولید مواد خاصی سبب مرگ پاتوژنها یا سایر میکروارگانیسمهای غیر مقیم هم می‌شوند (ساروم و ساند، ۲۰۰۱). در طول چند سال گذشته، تجزیه و تحلیل بسیاری از ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک در ایزوله‌های انسانی و دامی، در پاتوژن ها و فلور نرمال، اهمیت اینتگرونها در انتشار مقاومت در میان پاتوژن های باکتریایی را تایید کرد (کاراتولی، ۲۰۰۱). درطی مطالعه‌ای معلوم شد ۶۳% باکتریهای اشریشیا‌کولی مقاوم به چند دارو در ماکیان، کلاس۱ اینتگرونها را داشته‌اند (باس و همکاران، ۱۹۹۹). سالن و همکاران گزارش کردند که ۵۹% باکتریهای گرم منفی روده‌ای مربوط به نمونههای انسانی حاوی کلاس۱ اینتگرونها بوده‌اند (سالن و همکاران، ۱۹۹۵؛ باس وهمکاران، ۱۹۹۹). گلدشتاین و همکاران توزیع اینتگرونهای کلاس۱و۲ در میان باکتریهای نمونههای بالینی و انواع همزیست را در دامها، حیوانات خانگی و حیوانات نادر مورد بررسی قرار دادند. ۴۶% این جدایه ها، کلاس۱ اینتگرونها را داشتند (گلدشتاین و همکاران، ۲۰۰۱).
اینتگرونها در طبیعت رایج هستند. آنها در میان جدایههای همزیست و بیماریزای حیوانات و انسانها یافت شده‌اند. بیش از ۶۰ ژن مقاومت دارویی در کلاس۱ اینتگرونها شناسایی شده است. مهمتر از آن اینکه، مطالعات به وضوح مبادله‌ی ژنهای مقاومت آنتی‌بیوتیکی را در میان اینتگرونها نشان داده‌اند. بنابراین اینتگرونها ابزارهای مهمی در تکامل سریع و انتشار مقاومت به آنتی بیوتیک در میان باکتریهای گرم منفی به شمار می‌روند (روکی، ۲۰۰۲).
در طی مطالعه ای در سال ۱۹۹۹ تقریبا در ۳۶ % موارد جدایه های E. coli پاتوژن که از ماکیان بیمار بدست آمده بودند ، مقاومت چندگانه آنتی بیوتیکی به تتراسایکلین ، اکسی تتراسایکلین، استرپتومیسین ،سولفونامید و جنتامیسین نشان دادند سپس این جدایه ها برای حضور کلاس ۱ اینتگرونها غربالگری شدند تا سهم آنها در ایجاد مقاومت های چندگانه معین شود ، که با آنالیز PCR معین شد ۶۳ % جدایه های کلینیکی مثبت بودند (باس و همکاران، ۱۹۹۹).
در چین در۴۷ % E. coli های جدا شده از ۷۱ مرغ گوشتی، کلاس ۱ اینتگرونها شناسایی شد که اغلب آنها حاوی ژنهای مقاومت به استرپتومیسین وتری متوپریم بودند (یانگ و همکاران، ۲۰۰۴).
در سال ۲۰۰۶ طی مطالعه‌ای اثر تجویز سه داروی اکسی تتراسایکلین ، سارافلوکساسین ،انروفلوکساسین بر توزیع فاکتورهای مقاومت درمیان E. coliهای جدا شده از طیور گوشتی بررسی شد وشیوع بالایی از کلاس ۱ اینتگرونها در این جدایه ها دیده شد که اکثر آنها کاست مقاومت به استرپتومیسین را داشتند (اسمیت و همکاران، ۲۰۰۷).
در تونس ژنهای مقاومت به سولفونامید واینتگرونها در ۱۶۶جدایه یE. coli بدست آمده از گوشت طیور بررسی شد.کلاس ۱ و(یا) ۲ اینتگرونها در ۵۲ % این جدایه ها تشخیص داده شدند، این مطالعه بر نقش جدایه های E. coli گوشت طیور به عنوان یک مخزن مهم برای ژنهای مقاومت به سولفونامیدها واینتگرونهای حامل ژنهای مقاومت آنتی بیوتیکی تاکید دارد (صوفی و همکاران، ۲۰۰۹).
فصل سوم: مواد و روش کار
۱-۳- مواد و وسایل مورد نیاز
جدول ۱-۳: دستگاهها وسائل آزمایشگاهی مورد استفاده
| دستگاهها | وسایل آزمایشگاهی |
| ترموسایکلر BIORAD | لوپ و نیدل باکتریولوژی |
| دستگاه الکتروفورز (پایا پژوهش) | پتریدیش شیشه ای ۲۰ سانتی متری |
| ترازوی دقیق Sartorius با حساسیتmg 1/0 |
تیوب میکروسانترفیوژ استریل ۵/. و۵/۱ ml |
| دستگاه ترانس ایلومیناتور مجهز به لامپUV مارک UV.Tec | Collection tube |
| هود باکتریولوژی |
سمپلر ۲۰ و ۱۰۰ و۱۰۰۰ میکرولیتری مارکeppendorf |
|
میکروسانتریفیوژ و اسپین ساخت شرکت KIAGEN |
سرسمپلر زرد و آبی ۱۰۰ و ۱۰۰۰ میکرولیتری |
| سانترفیوژ | سوآپ پنبه‌ای استریل |
| اتوکلاو | دستکش پلاستیکی پویش و دستکش لاتکس |
| مایکروویو | تانک الکتروفورز |
| آوِن |
قالبهای مخصوص الکتروفورز و شانه‌های مخصوص آن (comb) |
| یخچال فریزر ۲۰- | ارلن ۲۵۰ و ۱۰۰۰ سیسی |
| یخچال ۴ درجه سانتی گراد | استوانه مدرج ۱۰۰ و ۱۰۰۰سیسی |
| حمام آب جوش | پارافیلم |
جدول ۲-۳: مواد شیمیایی مورد استفاده
| پودر آگارز (سیناژن، ایران) | MgCl2 (سیناژن، ایران) |
|
بافر TAE استوک ۵۰X ومحلول کار ۱X |
Taq DNA polymerase (سیناژن، ایران) |
|
DNA ladder 100bp (سیناژن، ایران) |
آگار مولر هینتون Muller- hinton agar |
| رنگ اتیدیوم بروماید (سیناژن، ایران) | Mc Conkey agar |
|
جفت پرایمرهای سنتز شده ژن فناوران |
Triple sugar Iron agar (TSI) |
| بافر بارکننده (Loading buffer) | Eosin- methylen blue agar (EMB) |
| ۱۰x PCR Buffer | Citrate base medium |
| dNTPs (سیناژن) | Tryptose soy broth (TSB) |
| رنگ‌‌های رنگ آمیزی گرم | MR/VP medium |
۲-۳- روش کار
۱-۲-۳- نمونه گیری
نمونه گیری جهت جداسازی باکتری از ۲۰ واحد تولیدی جوجه‌های گوشتی واقع در شهرستان‌های استان فارس، انجام گرفت. نمونه گیری در سه مرحله انجام شد. نمونه‌گیری مرحله اول از جوجه‌های یک روزه داخل کارتن، نمونه‌گیری مرحله دوم در سنین مابین ۳۵-۲۵ روزگی و نمونه‌گیری مرحله سوم در هنگام بارگیری انجام شد.
در هر مرحله‌ی نمونه‌گیری، از هر فارم ۱۵ سواب کلواکی گرفته شد و بلافاصله در لوله های شیشه ای درپوش دار حاوی محیط TSB قرار داده شد و بلافاصله به آزمایشگاه منتقل شد. در آزمایشگاه ۱۵ سواب کلواکی گرفته شده از هر فارم بصورت سه تایی با هم مخلوط شد و در نهایت از هر فارم پنج محیط TSB ( هرمحیط مخلوط ۳ نمونه) بدست آمد. از هر محیط TSBمخلوط شده با بهره گرفتن از آنس استریل بر روی محیط EMB کشت داده شد و متعاقبا به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد قرار گرفت (در نهایت در هر مرحله نمونه گیری از هر گله ۵ جدایه بدست آمد). از هر کدام از محیط های آگار ائوزین متیلن بلو (EMB agar) که پس از گرم‌خانه گذاری حاوی کلنی های آبی ـ سیاه با مرکز تیره که جلای فلزی متمایل به سبز داشتند یک پرگنه مجزا برداشته شد و بر روی محیط مک‌کانکی کشت داده شد. پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتی گراد از کلنی های صورتی رنگ مجزا و تکی برای آزمایشهای تاییدی استفاده شد (کوئین و همکاران، ۱۹۹۴الف).
۲-۲-۳- آزمون های تاییدی
رنگ آمیزی گرم: از هر یک از ۵ پلیت مک کانکی کشت داده شده در هر مرحله از نمونه گیری چند کلنی مجزا برداشته شده و پس از تهیه اسمیر بر روی لام و خشک کردن آن توسط حرارت، ابتدا بر روی لام محلول کریستال ویوله ریخته و پس از ۶۰ ثانیه با آب شسته شده و برای تثبیت رنگ به آن لوگول اضافه شده و پس از ۶۰ ثانیه با آب شسته شد. پس از شستشو برای رنگ زدایی به مدت ۱۵ ثانیه الکل استون بر روی لام ریخته شد. در نهایت پس از شستشو با آب، سطح لام به مدت ۶۰ ثانیه با سافرانین پوشانده شد و پس از شستشو با آب و خشک کردن لام در زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفت. باکتری های گرم منفی مانند اشریشیا کولیپس از رنگ آمیزی گرم به رنگ قرمز دیده می شوند درحالیکه باکتری های گرم مثبت بنفش رنگ اند. پس از تایید گرم منفی بودن
نمونه ها پلیت های مربوطه برای انجام آزمایشهای تاییدی بعدی استفاده شدند.
آزمایش کاتالاز: ابتدا یک لوپ از کلونی باکتری را به صورتی که به محیط آگار برخورد نکند برداشته و پس از قرار دادن بر روی یک اسلاید میکروسکوپی تمیز یک قطره هیدروژن پراکسید سه درصد به آن اضافه می شد. جوشیدن گاز هیدروژن در طی چند ثانیه معیار مثبت بودن آزمون کاتالاز در نظر گرفته می شد (اشریشیا‌کولی کاتالاز مثبت است).
آزمایش اکسیداز: ابتدا تکه ای از یک کاغذ فیلتر در داخل یک پتری دیش با محلول آبی یک درصد تترا متیل پی فنیلن دیامید هیدروکلراید خیس شده و باکتری با بهره گرفتن از یک میله شیشه ای (پی‌پت پاستور) به روی سطح کاغذ فیلتر کشیده می شد. دیده شدن یک رنگ ارغوانی تیره در امتداد خط کشت در طی ۱۰ ثانیه به عنوان معیار مثبت بودن واکنش در نظر گرفته می شد (اشریشیا‌کولی اکسیداز منفی است).
نمونه هایی که آزمایش کاتالاز آن ها مثبت و آزمایش اکسیدازشان منفی بود برای انجام آزمایش های تاییدی بعدی مورد استفاده قرار گرفتند.
آزمایش سیترات: با بهره گرفتن از آنس تعدادی کلنی از روی محیط مک کانکی برداشته و روی محیط شیب دار سیمون سیترات کشت داده می شد. اگر در طی ۴۸-۲۴ ساعت پس از انکوباسیون محیط به همان رنگ سبز اولیه باقی می‌ماند، آزمایش سیترات منفی و در صورتی که محیط آبی رنگ می شد، سیترات مثبت در نظر گرفته می شد (اشریشیا کولی سیترات منفی است).
آزمایش لیزین: با بهره گرفتن از آنس به محیط مایع حاوی لیزین دکربوکسیلاز مقداری کلنی باکتری اضافه کرده و سپس برای بی‌هوازی کردن محیط کشت به آن پارافین اضافه می شد. محیط در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۴۸-۲۴ انکوبه می شد. اگر رنگ محیط پس از گذشت این مدت زرد می شد، لیزین منفی و اگر بنفش می شد، لیزین مثبت در نظر گرفته می شد (اشریشیا کولی لیزین مثبت است).
آزمایش اندول: از محیط کشت مک کانکی با بهره گرفتن از آنس بر روی پپتون براث استریل کشت داده و به مدت ۴۸-۲۴ ساعت در ۳۷ درجه انکوباسیون انجام می شد. سپس نیم میلی لیتر واکنشگر کواک به محیط کشت داده شده، اضافه شده و لوله حاوی محیط تکان داده می شد. پس از گذشت یک دقیقه نتیجه قرائت می شد. تشکیل یک لایه قرمز رنگ در سطح محیط براث نشانه نتیجه مثبت و تشکیل یک لایه زرد رنگ، بیانگر نتیجه منفی آزمایش بود (اشریشیا کولیاندول منفی است).
آزمایش متیل رد (MR): پنج میلی لیتر از محیط براث MR-VP را در یک لوله آزمایش ریخته و پس از کشت دادن به مدت ۴۸-۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد، ۵ قطره واکنشگر MR به محیط اضافه شده و لوله به آرامی تکان داده می شد تا واکنشگر در محیط حل شود. اگر رنگ محیط قرمز می شد، نتیجه مثبت و اگر زرد می شد، نتیجه آزمایش منفی در نظر گرفته می شد ( اشریشیا کولی متیل رد مثبت است).
آزمایش ووژ- پروسکوئر (VP): پنج میلی لیتر از محیط براث MR-VP را در یک لوله آزمایش ریخته و پس از کشت دادن بمدت ۴۸-۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد، سه میلی لیتر آلفا نفتول ۵ درصد در اتیل الکل خالص به محیط اضافه شده و سپس یک میلی لیتر هیدروکسید پتاسیم ۴۰ درصد به آن اضافه شده و لوله تکان داده می شد. پس از گذشت ۵ دقیقه اگر محلول بی رنگ بود، آزمایش منفی و اگر اگر قرمز می شد، آزمایش مثبت در نظر گرفته می شد (آزمایش VP در مورد اشریشیا کولی منفی است).
آزمایش اوره: باکتری را در محیط اوره دارای معرف فنل رد کشت داده و پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد نتیجه خوانده میشد. زرد شدن محیط معیار منفی بودن و قرمز شدن آن معیار مثبت شدن واکنش در نظر گرفته می شد (اشریشیا کولی اوره منفی است).
آزمایش TSI: با بهره گرفتن از آنس چند کلونی از روی محیط مک کانکی برداشته و در محیط TSI شیب دار کشت داده و پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد نتیجه قرائت می شد. در مورد اشریشیا‌کولی هم سطح شیب دار و هم سطح پایینی لوله می بایست زرد رنگ می شد.
در صورتی که نتیجه هر یک از آزمایش های مورد نظر با اشریشیا کولی مطابقت نداشت، آزمایش مورد نظر تکرار می شد و در صورت عدم مطابقت دوباره، نمونه مورد نظر دوباره کشت و جداسازی شده و آزمایش های تاییدی بر روی این نمونه جدید انجام می شد.
پس از تایید اشریشیا کولی توسط آزمایشهای بیوشیمیایی نمونه ها، از روی محیط مک کانکی یک کلنی مجزا برداشته و در محیط TSB کشت داده می شد. پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتی گراد، یک میلی لیتر از محیط TSB حاوی باکتری به همراه ۳/. میلی لیتر گلیسرول در میکروتیوبهای استریل ریخته شده و برای نگهداری تا زمان انجام آزمایشات بعدی به فریزر ۷۰- درجه سانتیگراد منتقل شد.
۳-۲-۳- آنتیبیوتیکهای مورد استفاده برای آنتی‌بیوگرام
جدول ۳-۳: آنتیبیوتیکهای استفاده شده برای آنتی‌بیوگرام
| عامل آنتی باکتریال مورد آزمایش | مقدار ماده موثره در هر دیسک (میکروگرم) |
| آمپی سیلین | ۱۰ |
| سیپروفلوکساسین | ۵ |
| کلیسیتین | ۱۰ |
| انروفلوکساسین | ۵ |
| اریترومایسین | ۱۵ |
| فلومکوئین | ۳۰ |
| جنتامایسین | ۱۰ |
| لینکواسپکتین | ۱۵/۲۰۰ |
| نالیدیکسیک اسید | ۳۰ |
| نئومایسین | ۳۰ |
| نورفلوکساسین | ۱۰ |
| اکسی تتراسایکلین | ۳۰ |
| استرپتومایسین | ۱۰ |
| سولفامتوکسازول+تری متوپریم | ۲۳٫۷۵‚۲۵/۱ |
| تتراسایکلین | ۳۰ |
| کلرامفنیکل | ۳۰ |
| فلورفنیکل | ۳۰ |
| فورازولیدون | ۱۰۰ |
۴-۲-۳- آزمون حساسیت آنتی بیوتیکی
برای تعیین حساسیت ۳۰۰ جدایه اشریشیا کولی نسبت به داروهای آنتی باکتریال ، روش دیسک دیفیوژن[۴۳] بر اساس روش استاندارد Kirby-Bauer و بر روی محیط آگاردار مولر هینتون مورد استفاده قرار گرفت (کوئین و همکاران، ۱۹۹۴الف). روش انجام آنتی‌بیوگرام برای ۳۰۰ جدایه‌ی مورد نظر به این شرح بود که نمونه ها پس از خارج شدن از فریزر ۷۰- درجه سانتیگراد بر روی محیط مک‌کانکی کشت داده شدند. پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتی گراد، ۴ تا ۵ کلنی تکی اشریشیا‌کولی از محیط مک کانکی برداشته و به لوله آزمایش استریل درب دار محتوی محیط مایع تریپتون سوی براث (TSB) انتقال داده شده و محیط مایع تلقیح شده به مدت ۲ تا ۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد تا زمان مشاهده یک کدورت واضح و منطبق با کدورت استاندارد ۵/۰ مک فارلند (معادلCFU/mL 108) گرم‌خانه‌گذاری شد. سپس یک سواپ استریل را به درون این سوسپانسیون باکتریایی وارد نموده و مایع اضافی سواب را با فشار دادن آن به جدار داخلی لوله حاوی سوسپانسیون باکتریایی گرفته و به صورت خطی و بدون فاصله بین خطوط کشت بر روی سطح محیط مولر هینتون کشت داده می شد. به منظور تلقیح یکنواخت کشت خطی سه بار انجام می شد. پلیت های تلقیح شده به مدت ۳ تا ۵ دقیقه به همان حال باقی می‌ماندند تا رطوبت اضافی آن ها قبل از گذاشتن دیسک‌های آنتی‌بیوگرام توسط آگار جذب شود. سپس دیسک های مورد آزمایش که از یک ساعت قبل به منظور رسیدن به درجه حرارت آزمایشگاه از یخچال خارج شده بودند توسط پنس استریل بر روی سطح محیط مولر‌هینتون تلقیح شده، قرار داده میشدند. در زمان قرار دادن دیسکها بر روی محیط کشت فاصله ۲۴ میلیمتری دیسکها از همدیگر و ۱۵ میلیمتری از جدار پلیت رعایت میشد. قرار دادن دیسکها ظرف ۱۵ دقیقه انجام شده و سپس پلیت‌ها جمع آوری شده و در وضعیت وارونه به مدت ۱۸ ساعت در ۳۵ درجه سانتی گراد انکوبه[۴۴] میشدند (کوئین و همکاران، ۱۹۹۴الف).
سپس قطر هاله اطراف هر دیسک با خط کش اندازه‌گیری شد.
تفسیر نتایج آزمایش حساسیت آنتی بیوتیکی با بهره گرفتن از معیارهای CLSI (NCCLS,2002) انجام شد (جدول۴-۳). از جدایه ATCC 25922 E. coli، به عنوان کنترل استفاده شد.
جدول۴-۳: دیسک‌های آنتی‌بیوتیک استفاده شده، مقادیر ماده موثره آنها و تفسیر نتایج آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی (سی ال اس آی، ۲۰۰۲).
| آنتی بیوتیک | مقدار ماده موثره (μg) | قطر هاله رشد (برحسب میلی متر) معادل با حساسیت یا مقاومت | ||
| حساسیت | مقاومت متوسط | مقاومت | ||
| آمپی سیلین | ۱۰ | ≥ ۱۷ | ۱۶-۱۴ | ≤ ۱۳ |
| جنتامایسین | ۱۰ | ≥ ۱۵ | ۱۴-۱۳ | ≤ ۱۲ |
| استرپتومایسین | ۱۰ | ≥ ۱۵ | ۱۴-۱۲ | ≤ ۱۱ |
| تتراسیکلین | ۳۰ | ≥ ۱۹ | ۱۸-۱۵ | ≤ ۱۴ |
| سیپروفلوکساسین | ۵ | ≥ ۲۱ | ۲۰-۱۶ | ≤ ۱۵ |
| نورفلوکساسین | ۱۰ | ≥ ۱۷ | ۱۶-۱۳ | ≤ ۱۲ |
| اسید نالیدیکسیک | ۳۰ | ≥ ۱۹ | ۱۸-۱۶ | ≤ ۱۵ |
| انروفلوکساسین | ۵ | ≥ ۲۳ | ۲۲-۱۷ | ≤ ۱۶ |
| فلومکوئین | ۳۰ | ≥ ۲۰ | ۱۹-۱۷ | ≤ ۱۶ |
| تریمتوپریم/سولفا | ۷۵/۲۳ ‚ ۲۵/۱ | ≥ ۱۶ | ۱۵-۱۱ | ≤ ۱۰ |
| کلرامفنیکل | ۳۰ | ≥ ۱۸ | ۱۷-۱۳ | ≤ ۱۲ |
| فلورفنیکل | ۳۰ | ≥ ۱۹ | ۱۸-۱۵ | ≤۱۴ |
| اکسی تتراسیکلین | ۳۰ | ≥ ۱۹ | ۱۸-۱۵ | ≤ ۱۴ |
| کلیسیتین | ۱۰ | ≥ ۱۵ | - | <14 |
| نئومایسین | ۳۰ | ≥ ۱۷ | ۱۶-۱۳ | ≤ ۱۲ |
| فورازولیدون | ۱۰۰ | ≥ ۱۹ | ۱۸-۱۵ | <14 |
| لینکواسپکتین | ۱۵/۲۰۰ | ≥ ۲۰ | ۱۹-۱۷ | ≤ ۱۶ |
| اریترومایسین | ۱۵ | ≥ ۲۳ | ۲۲-۱۴ | ≤ ۱۳ |
۵-۲-۳- روش ساخت نیم مک فارلند[۴۵]:
محلول A: (M Bacl2 0.48). 72/1گرم BaCl2.H2O2 با آب مقطر استریل به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
محلول B: (N H2SO4 0.36). 1 میلی لیتر H2SO4 با آب مقطر استریل به حجم ۱۰۰ ml رسانده شد.
محلول stock: نیم میلی لیتر از محلول A با ۵/۹۹ میلی لیتر از محلول B مخلوط گردید.
(محلول stock درون ظرف با پوشش آلومینیومی درون یخچال به مدت ۶ ماه قابل استفاده است. اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شد ، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود . در هنگام استفاده ظرف حاوی محلول مورد نظر به خوبی تکان داده شد (لوریان، ۲۰۰۵).
جدول ۵-۳: خصوصیات روش آزمایش آنتی بیوگرام (دیسک دیفیوژن)
بر اساس معیارهای CLSI (NCCLS)
| محیط پایه | مولر هینتون آگار |
| pH | ۴/۷-۲/۷ در دمای اتاق |
| قطر جامد محیط در پلیت شیشه ای | ۴ میلیمتر |
| مدت زمان نگهداری پلیت ها | ۷ روز در دمای ۸-۲ درجه سانتیگراد بدون خشک شدن |
| محیط کشت مایع | TSB |
| تعداد کلونی برای کشت در محیط مایع | ۵-۳ کلونی |
| Inoculums calibration | ۵/۰ مک فارلند |
| تعداد دیسک ها و فاصله آن ها از هم | ۶-۵ عدد در پلیت با قطر ۱۰۰-۹۰ میلیمتر و فاصله مرکز یک دیسک با دیسک دیگر ۲۴ میلیمتر |
| زمان بین کشت و گذاشتن دیسکها | کمتر از ۱۵ دقیقه |
۶-۲-۳- نکات مورد توجه در انجام آزمایش آنتی بیوگرام
آزمایش در زیر هود و در کنار شعله انجام شد.
قبل از بردن باکتری بر روی محیط “مولر هینتون” از عدم رشد یا وجود باکتری بر روی آن اطمینان حاصل گردید.
از سواب استریل برای کشت بر روی محیط استفاده شد.
هنگام گذاشتن دیسک ها بر روی محیط آن ها را بر روی محیط کمی فشار داده و از جا به جا کردن پرهیز گردید.
هر بار قبل از گذاشتن دیسک ها توسط پنس بر روی محیط، پنس شعله داده شد.
پلیت های کشت داده شده حاوی دیسک آنتی بیوگرام به صورت وارونه در انکوبانتور قرار گرفت
از پلیت های شفاف و بدون کدورت برای سهولت خواندن نتایج استفاده گردید.
دستگاه انکوباتور قبل از گذاشتن پلیت ها و شیشه ها درون آن از لحاظ عمل چک گردید.
در پایان کار پلیت ها و لوله های حاوی باکتری برای جلوگیری از گسترش آلودگی جمع آوری و درون دستگاه اتوکلاو استریل شدند.
۷-۲-۳- نکات مورد توجه در اندازه گیری قطر هاله و خواندن نتایج آزمایش آنتی بیوگرام
در اندازه گیری از خط کش معمولی و یا ویژه این کار استفاده شد.
برای اندازه گیری امتداد خط کش از وسط دیسک عبور می‌کرد.
در ارتباط با هر دیسک قطر هاله اندازه‌گیری شد.
اگر در اطراف دیسک حتی یک کلونی هم وجود داشت از همان جا تا دیسک اندازه‌گیری گردید نه کل هاله.
دیسکها و هاله‌ها در زیر نور بررسی شد.
۸-۲-۳- بررسی حضور مقاومت‌های چند گانه
جهت ارزیابی وجود مقاومت های چندگانه در این بررسی، وجود مقاومت به آنتی بیوتیک شاخص در هر یک از خانواده های آنتی بیوتیکی مهم در نظر گرفته شد. بدین منظور ۷ آنتی بیوتیک جنتامایسین، سیپروفلوکساسین، آمپی سیلین، تتراسیکلین، کلرامفنیکل، تریمتوپریم/سولفا و کلیسیتین بعنوان آنتی بیوتیک های شاخص انتخاب شدند (ماجیوراکوس و همکاران، ۲۰۱۲). مقاومت های چند گانه به سه دسته مقاومت آنتی‌بیوتیکی به چندین دارو[۴۶]، مقاومت گسترده آنتی بیوتیکی[۴۷] و مقاومت کامل آنتی بیوتیکی[۴۸] طبقه بندی شدند که در آن مقاومت چندگانه آنتی بیوتیکی یا MDR شامل جدایه هایی می شد که حداقل به یک آنتی بیوتیک شاخص در ۳ یا تعداد بیشتری از خانواده های آنتی بیوتیکی مقاوم بودند. مقاومت گسترده آنتی بیوتیکی یا XDR در مورد جدایه هایی بکار رفت که حداقل به یک آنتی بیوتیک شاخص در همه خانواده های آنتی بیوتیکی باستثنای یک و یا دو خانواده آنتی بیوتیکی مقاوم بودند. اصطلاح مقاومت آنتی بیوتیکی کامل یا PDR در مورد جدایه هایی استفاده شد که به همه آنتی بیوتیک های شاخص در تمامی گروه های آنتی بیوتیکی مقاوم بودند (ماجیوراکوس و همکاران، ۲۰۱۲).
۹-۲-۳- استخراج DNA جهت انجام آزمایشهای مولکولی
استخراج DNA به روش جوشاندن انجام گرفت (سامبوروک و همکاران، ۱۹۸۹). در این روش پس از خالص سازی اولیه، چند کلنی مجزای صورتی رنگ از روی محیط مک کانکی برداشته شده و در میکروتیوب های ۵/۱ میلی لیتری حاوی ۲۵۰ میکرو لیتر بافر شستشو [۴۹]حل شدند. بافر حاوی کلنی های باکتری به مدت ۲۰- ۱۵ ثانیه ورتکس شده و سپس به مدت ۵ دقیقه در آبجوش ۱۰۰ درجه ساتی گراد قرار داده می شد. پس از این مرحله میکروتیوب های حاوی کلنی های جوشیده شده به مدت ۱۵ دقیقه در دستگاه سانتریفیوژ با دور rpm 6000 سانتریفیوژ شده و پس از اتمام کار مایع رویی جمع آوری شده و به عنوان منبع DNAاستفاده گردید. DNA های استخراج شده تا زمان انجام آزمایش PCR در فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
جدول ۶-۳: اطلاعات نمونه های کارشده ، گرفته شده از مزارع گوشتی شهرستان شیراز
| مرحله نمونه گیری | ایزوله های E. coli | محل جداسازی (فارم) |
شماره نمونه (کد یخچالی) |
| مرحله اول | ۳-۱-۳ | شیراز | ۱۸ |
| ۲-۱-۴ | داریون | ۲۷ | |
| ۵-۱-۴ | داریون | ۳۰ | |
| ۳-۱-۵ | خان زنیان | ۳۳ | |
| ۲-۱-۶ | زرقان | ۳۷ | |
| ۴-۱-۶ | زرقان | ۳۹ | |
| ۵-۱-۶ | زرقان | ۴۰ | |
| ۱-۱-۸ | جاده بوشهر | ۴۶ | |
| ۲-۱-۸ | جاده بوشهر | ۴۷ | |
| ۳-۱-۸ | جاده بوشهر | ۴۸ | |
| ۴-۱-۸ | جاده بوشهر | ۴۹ | |
| ۵-۱-۸ | جاده بوشهر | ۵۰ | |
| ۱-۱-۹ | لپویی | ۵۱ | |
| ۲-۱-۹ | لپویی | ۵۲ | |
| ۴-۱-۹ | لپویی | ۵۴ | |
| ۲-۱-۱۱ | زرقان | ۶۲ | |
| ۳-۱-۱۱ | زرقان | ۶۳ | |
| ۴-۱-۱۱ | زرقان | ۶۴ | |
| ۵-۱-۱۱ | زرقان | ۶۵ | |
| ۱-۱-۱۳ | سیاخ دارنگان | ۷۱ | |
| ۲-۱-۱۳ | سیاخ دارنگان | ۷۲ | |
| ۳-۱-۱۳ | سیاخ دارنگان | ۷۳ | |
| ۴-۱-۱۳ | سیاخ دارنگان | ۷۴ | |
| ۵-۱-۱۳ | سیاخ دارنگان | ۷۵ | |
| ۱-۱-۱۴ | داریون | ۷۶ | |
| ۲-۱-۱۴ | داریون | ۷۷ | |
| ۳-۱-۱۴ | داریون | ۷۸ | |
| ۴-۱-۱۴ | داریون | ۷۹ | |
| ۵-۱-۱۴ | داریون | ۸۰ | |
| ۴-۱-۱۸ | سروستان | ۹۹ | |
| ۱-۱-۱۹ | داریون | ۱۰۱ | |
| ۳-۱-۱۹ | داریون | ۱۰۳ | |
| ۴-۱-۱۹ | داریون | ۱۰۴ | |
| ۵-۱-۱۹ | داریون | ۱۰۵ | |
| ۲-۱-۲۰ | داریون | ۱۰۷ | |
| ۳-۱-۲۰ | داریون | ۱۰۸ | |
| ۴-۱-۲۰ | داریون | ۱۰۹ | |
| ۵-۱-۲۰ | داریون | ۱۱۰ | |
| مرحله دوم | ۱-۲-۲ | بید زرد | ۱۱۶ |
| ۲-۲-۲ | بید زرد | ۱۱۷ | |
| ۳-۲-۲ | بید زرد | ۱۱۸ | |
| ۱-۲-۳ | شیراز | ۱۲۱ | |
| ۴-۲-۳ | شیراز | ۱۲۴ | |
| ۵-۲-۳ | شیراز | ۱۲۵ | |
| ۳-۲-۴ | داریون | ۱۲۸ | |
| ۴-۲-۴ | داریون | ۱۲۹ | |
| ۵-۲-۴ | داریون | ۱۳۰ | |
| ۲-۲-۵ | خان زنیان | ۱۳۲ | |
| ۱-۲-۶ | زرقان | ۱۳۶ | |
| ۲-۲-۶ | زرقان | ۱۳۷ | |
| ۵-۲-۶ | زرقان | ۱۴۰ | |
| ۴-۲-۷ | دشت ارژن | ۱۴۴ | |
| ۵-۲-۷ | دشت ارژن | ۱۴۵ | |
| ۱-۲-۸ | جاده بوشهر | ۱۴۶ | |
| ۲-۲-۸ | جاده بوشهر | ۱۴۷ | |
| ۳-۲-۸ | جاده بوشهر | ۱۴۸ | |
| ۴-۲-۸ | جاده بوشهر | ۱۴۹ | |
| ۵-۲-۸ | جاده بوشهر | ۱۵۰ | |
| ۱-۲-۹ | لپویی | ۱۵۱ | |
| ۲-۲-۹ | لپویی | ۱۵۲ | |
| ۳-۲-۹ | لپویی | ۱۵۳ | |
| ۵-۲-۹ | لپویی | ۱۵۵ | |
| ۱-۲-۱۰ | جاده بوشهر | ۱۵۶ | |
| ۲-۲-۱۰ | جاده بوشهر | ۱۵۷ | |
| ۳-۲-۱۰ | جاده بوشهر | ۱۵۸ | |
| ۴-۲-۱۰ | جاده بوشهر | ۱۵۹ | |
| ۵-۲-۱۰ | جاده بوشهر | ۱۶۰ | |
| ۱-۲-۱۱ | زرقان | ۱۶۱ | |
| ۲-۲-۱۱ | زرقان | ۱۶۲ | |
| ۴-۲-۱۱ | زرقان | ۱۶۴ | |
| ۱-۲-۱۴ | داریون | ۱۷۶ | |
| ۲-۲-۱۴ | داریون | ۱۷۷ | |
| ۴-۲-۱۵ | فراشبند | ۱۸۴ | |
| ۱-۲-۱۶ | لپویی | ۱۸۶ | |
| ۲-۲-۱۶ | لپویی | ۱۸۷ | |
| ۳-۲-۱۶ | لپویی | ۱۸۸ | |
| ۴-۲-۱۶ | لپویی | ۱۸۹ | |
| ۵-۲-۱۶ | لپویی | ۱۹۰ | |
| ۱-۲-۱۷ | خرامه | ۱۹۱ | |
| ۲-۲-۱۷ | خرامه | ۱۹۲ | |
| ۴-۲-۱۷ | خرامه | ۱۹۴ | |
| ۵-۲-۱۷ | خرامه | ۱۹۵ | |
| ۱-۲-۱۸ | سروستان | ۱۹۶ | |
| ۳-۲-۱۸ | سروستان | ۱۹۸ | |
| ۴-۲-۱۸ | سروستان | ۱۹۹ | |
| ۵-۲-۱۸ | سروستان | ۲۰۰ | |
| ۲-۲-۱۹ | داریون | ۲۰۲ | |
| ۵-۲-۱۹ | داریون | ۲۰۵ | |
| ۱-۲-۲۰ | داریون | ۲۰۶ | |
| ۲-۲-۲۰ | داریون | ۲۰۷ | |
| ۳-۲-۲۰ | داریون | ۲۰۸ | |
| ۴-۲-۲۰ | داریون | ۲۰۹ | |
| ۵-۲-۲۰ | داریون | ۲۱۰ | |
| مرحله سوم | ۳-۳-۲ | بید زرد | ۲۸۷ |
| ۴-۳-۲ | بید زرد | ۲۸۸ | |
| ۲-۳-۳ | شیراز | ۲۹۶ | |
| ۴-۳-۳ | شیراز | ۲۹۸ | |
| ۵-۳-۳ | شیراز | ۲۹۹ | |
| ۲-۳-۴ | داریون | ۳۰۱ | |
| ۳-۳-۴ | داریون | ۳۰۲ | |
| ۴-۳-۴ | داریون | ۳۰۳ | |
| ۲-۳-۵ | خان زنیان | ۳۰۶ | |
| ۵-۳-۵ | خان زنیان | ۳۰۹ | |
| ۴-۳-۶ | زرقان | ۳۱۳ | |
| ۲-۳-۷ | دشت ارژن | ۳۱۶ | |
| ۳-۳-۷ | دشت ارژن | ۳۱۷ | |
| ۵-۳-۷ | دشت ارژن | ۳۱۹ | |
| ۱-۳-۸ | جاده بوشهر | ۳۲۰ | |
| ۳-۳-۸ | جاده بوشهر | ۳۲۲ | |
| ۴-۳-۸ | جاده بوشهر | ۳۲۳ | |
| ۵-۳-۸ | جاده بوشهر | ۳۲۴ | |
| ۲-۳-۹ | لپویی | ۳۲۶ | |
| ۳-۳-۹ | لپویی | ۳۲۷ | |
| ۲-۳-۱۰ | جاده بوشهر | ۳۳۱ | |
| ۱-۳-۱۱ | زرقان | ۳۳۵ | |
| ۴-۳-۱۱ | زرقان | ۳۳۸ | |
| ۲-۳-۱۲ | جاده بوشهر | ۳۴۱ | |
| ۵-۳-۱۲ | جاده بوشهر | ۳۴۴ | |
| ۱-۳-۱۳ | سیاخ دارنگان | ۳۴۵ | |
| ۵-۳-۱۴ | داریون | ۳۵۴ | |
| ۱-۳-۱۵ | فراشبند | ۳۵۵ | |
| ۵-۳-۱۵ | فراشبند | ۳۵۹ | |
| ۱-۳-۱۶ | لپویی | ۳۶۰ | |
| ۲-۳-۱۶ | لپویی | ۳۶۱ | |
| ۳-۳-۱۶ | لپویی | ۳۶۲ | |
| ۵-۳-۱۶ | لپویی | ۳۶۴ | |
| ۳-۳-۱۷ | خرامه | ۳۶۷ | |
| ۴-۳-۱۷ | خرامه | ۳۶۸ | |
| ۵-۳-۱۷ | خرامه | ۳۶۹ | |
| ۲-۳-۱۸ | سروستان | ۳۷۱ | |
| ۳-۳-۱۸ | سروستان | ۳۷۲ | |
| ۵-۳-۱۸ | سروستان | ۳۷۴ | |
| ۳-۳-۱۹ | داریون | ۳۷۷ | |
| ۴-۳-۱۹ | داریون | ۳۷۸ | |
| ۵-۳-۱۹ | داریون | ۳۷۹ | |
| ۱-۳-۲۰ | داریون | ۳۸۰ | |
| ۳-۳-۲۰ | داریون | ۳۸۲ | |
| ۴-۳-۲۰ | داریون | ۳۸۳ | |
| ۵-۳-۲۰ | داریون | ۳۸۴ |
۱۰-۲-۳- انجام واکنش های زنجیره ای پلیمراز
جدول ۷-۳: برنامه چرخه حرارتی PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز ۱[۵۰] واینتگراز ۲[۵۱]
| ردیف | مرحله | دما/زمان | |
| ۱ | واسرشت سازی اولیه | دما | º C94 |
| زمان | ۵ دقیقه | ||
| ۲ | واسرشت سازی | دما | º C 94 |
| زمان | ۴۵ ثانیه | ||
| ۳ | اتصال | دما | ۶۰ º C |
| زمان | ۱ دقیقه | ||
| ۴ | بسط | دما | ۷۲ º C |
| زمان | ۴۵ ثانیه | ||
| ۵ | بسط نهایی | دما | ۷۲ º C |
| زمان | ۵ دقیقه | ||
جدول ۸-۳: برنامه چرخه حرارتی PCR برای شناسایی کاست ژنی اینتگرون کلاس۱ [۵۲]
| ردیف | مرحله | دما/زمان | |
| ۱ | واسرشت سازی اولیه | دما | º C94 |
| زمان | ۵ دقیقه | ||
| ۲ | واسرشت سازی | دما | º C 94 |
| زمان | ۴۵ ثانیه | ||
| ۳ | اتصال | دما | ۶۰ º C |
| زمان | ۱ دقیقه | ||
| ۴ | بسط | دما | ۷۲ º C |
| زمان | ۱ دقیقه | ||
| ۵ | بسط نهایی | دما | ۷۲ º C |
| زمان | ۵ دقیقه | ||
جدول۹-۳: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی ژن های اینتگراز ۱ و اینتگراز ۲
| ژن | نام پرایمر | توالی پرایمر (´۵ به ´۳) | دمای اتصال (°C) | اندازه محصول (bp) | منبع |
| IntI1 | IntI1 -F | ACGAGCGCAAGGTTTCGGT | ۶۰ | ۵۶۵ | (سو و همکاران، ۲۰۰۶) |
| IntI1 -R | GAAAGGTCTGGTCATACATG | ||||
| IntI2 | IntI2 -F | GTGCAACGCATTTTGCAGG | ۶۰ | ۴۰۳ | (سو و همکاران، ۲۰۰۶) |
| IntI2 -R | CAACGGAGTCATGCAGATG |
جدول۱۰-۳: مشخصات مربوط به پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی کاست ژنی اینتگرون کلاس ۱
| توالی هدف | نام پرایمر | توالی پرایمر (´۵ به ´۳) | دمای اتصال (°C) | اندازه محصول (bp) | منبع |
|
Gene cassette of class 1 integron |
caset1 -F | GGCATACAAGCAGCAAGC | ۶۰ | متغیر | (ژانگ و همکاران، ۲۰۰۴) |
| caset1 -R | AAGCAGACTTGACCTGAT |
کلیه پرایمرهای نامبرده شده طی سفارشی توسط شرکت ژن فناوران سنتز شد. پس از رقیقسازی هر پرایمر طبق دستورالعمل شرکت سازنده، از هر پرایمر، محلولکاری با غلظت ۱۰ میکرومولار، فراهم گردید.
جدول۱۱-۳: غلظت استوک مواد اولیه مورد استفاده در واکنش زنجیرهای پلیمراز
| مواد | غلظت استوک |
|
بافر X10 واکنش زنجیرهای پلیمراز مخلوط dNTP DNA تک پلیمراز کلرید منیزیم |
X10 mM10 U/µl5 mM50 |
جدول ۱۲-۳: ساخت محلول کار آماده جهت انجام Multiplex PCR برای شناسایی ژنهای اینتگراز
| مواد | مقادیر حجم برداشتی (میکرولیتر) برای یک واکنش ۲۵ میکرولیتری |
| آب مقطر(D.W) | ۲۵/۱۶ |
| ۱۰x Buffer | ۵/۲ |
| MgCl2(50mM) | ۷۵/۰ |
| Primer F1+R1 (10µM) | ۱ |
| Primer F2+R2 (10µM) | ۵/۱ |
| dNTPs(10mM) | ۵/۰ |
| DNA Taq polymerase(5u/ µl) | ۵/۰ |
| جمع | ۲۳ |
۱۱-۲-۳- انجام واکنش PCR برای شناسایی ژن های اینتگراز ۱ و ۲
پس از آماده سازی مخلوط اصلی[۵۳] در کنار یخ و انجام یکبار سانتریفیوژ کوتاهمدت (به اصطلاح spin) به هر میکروتیوب ۵/۰ میلی لیتری واکنش PCR، ۲۳ میکرولیتر از مخلوط اصلی همگن شده، اضافه میشد. سپس با اضافهکردن DNA استخراجی (مربوط به نمونه‌هایی که مقاومت دارویی چندگانه داشتند) به میزان ۲ میکرولیتر به هر واکنش، میکروتیوبها آماده قرار گرفتن در دستگاه ترموسایکلر میشدند. لازم به ذکر است در هر سری واکنش کنترل مثبت و کنترل منفی در کنار دیگر نمونهها گذاشته میشد تا ارزش نتایج حاصل از PCR قابل اعتماد باشد. در پایان به تمامی میکروتیوبهای PCR روغن معدنی (mineral oil) اضافهشده تا از تبخیر محلول همگن جلوگیری شده و ترکیب واکنش به هم نخورد. پس از آماده سازی و اطمینان از بستهبودن درب تمامی نمونهها، آنها در دستگاه ترموسایکر بایوراد[۵۴] که از قبل برنامه خاص واکنش PCR به آن داده شده، قرار میگرفتند.
۱۲-۲-۳- الکتروفورز روی ژل آگارز
جدول ۱۳-۳: تهیه بافر TAE 50 بار به شرح ذیل صورت میپذیرد
| ۲۰cc | ۰٫۵ M, pH=8.3))EDTA |
| ۱۱٫۴۲cc | Acetic Acid |
| ۴۸٫۴۴g | Tris Base |
| ۱۰۰cc | آب مقطر(D.W) |
| پس از آنکه pH، با pHسنج روی ۳/۸ تنظیم گردید، حجم نهایی با آب مقطر به ۲۰۰ میلیلیتر رسانده می شود. | |
محصول PCR به دست آمده تا زمان انجام این مرحله در دمای ۲۰- نگهداری شد. الکتروفورز روشی است که منجر به حرکت مولکولهای باردار در میدان الکتریکی ثابت می شود. الکتروفورز ژل آگارز روش استاندارد، جهت بررسی، تفکیک و شناسایی قطعات DNA میباشد. برای انجام الکتروفورز میزان مورد نظر از پودر آگارز در بافر ۱X TAE حل می شود. برای الکتروفورز محصول PCR غلظت ۵/۱ درصد آگارز استفاده شد. ۱X TAE که محلول کار[۵۵] است از محلول استوک ۵۰X TAE بدست می‌آید به این صورت که محلول استوک با نسبت ۱به ۴۹ با آب مقطر رقیق میشود تا محلول کار حاصل شود. روش تهیه بافر TAE 50 بار غلظت بهشرح جدول (۱۳-۳) میباشد.
محلول شدن پودر آگارز در حلال (TAE 1X) با بهره گرفتن از حرارت ماکروویو و همزدن مداوم انجام شد، تا محلول آگارز کاملا شفاف گردید. پس از سرد شدن و رسیدن به دمای حدود ۵۰-۴۰ درجه سانتی گراد و برای مرئی شدن قطعات DNA زیر نورUV اتیدیوم بروماید (۷ میکرولیتر به ازای هر ۱۰۰ میلی لیتر ژل) افزوده شد و پس از مخلوط نمودن آن، به درون قالبهای مخصوص دستگاه الکتروفورز انتقال داده شد بطوریکه ضخامت آن ۵ میلیمتر باشد. پس از انجماد کامل ژل آگارز، با برداشتن شانه، چاهکهای محل استقرار نمونههای DNA پدیدار می شود. قالب مذکور که حاوی ژل آگارز تهیه شده میباشد به تانک الکتروفورز منتقل شد. بافر موجود در تانک (TAE 1X) بایستی به میزانی باشد که سطح آگارز را بپوشاند.
نکته: بایستی دقت شود که غلظت TAE بافر تانک با غلظت مورد استفاده آن برای ساخت ژل یکسان باشد و اینکه نباید غلظت بافر بیشتر از ۱X باشد زیرا در آن صورت طبق قانون اهم (V=q X R) مقاومت افزایش یافته و تولید حرارت بیشتر میشود که سبب اشکال در روند الکتروفورز و حرکت باندها شده و باعث انتشار[۵۶] باندها وکج شدن آنها میشود.
میزان ۵ میکرولیتر از محصول PCR، با ۱ میکرولیتر بافر بار کننده ۶X(نسبت ۱ به ۵ ) مخلوط کرده و به آرامی به درون چاهک ژل منتقل شد.
جهت محاسبه اندازه قطعات DNA، در چاهک اول از مارکر صد زوج بازی (GeneRuler DNA ladder plus, 100bp) استفاده شد. الکتروفورز ژل آگارز با شدت جریان حدود ۹۵ ولت به مدت۵۰ دقیقه صورت پذیرفت. در این مدت زمان، DNA به علت داشتن بار الکتریکی منفی به سمت قطب مثبت حرکت می کند. میزان حرکت DNA در بستر ژل بر اساس حرکت رنگ موجود در بافر بار کننده (که مربوط به رنگ برمو فنل بلو میباشد) ارزیابیشده بطوریکه در مدت زمان الکتروفورز (حدود۵۰ دقیقه)، حداقل دو سوم طول ژل را طی کند. در پایان کار تحت تابش نور ماورا بنفش دستگاه ترانس ایلومیناتور در طول موج۳۲۰ نانومتر، الگوی باندهای DNA نمونهها نشاندار و قابل رویت میگردد.
۱۳-۲-۳- شناسایی کاست ژنی اینتگرون
پس از انجام واکنش PCR برای ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ بر روی نمونههای DNA استخراج شده که مقاومت دارویی چندگانه داشتند (MDR) و بررسی وجود یا عدم وجود آن ژنها در محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز با بهره گرفتن از تفکیک محصولات بر روی ژل آگارز، نمونه‌هایی که دارای ژن اینتگراز ۱ بودند، برای بررسی وجود کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها و تعیین الگوی باندهای آنها، مجددا با روش PCR با پرایمر های سنتز شده برای کاست ژنی کلاس ۱، مورد آزمایش قرار گرفتند.
نمونه‌هایی که دارای اینتگراز کلاس دو بودند به ۲ علت مورد بررسی وجود کاست ژنی کلاس ۲ قرار نگرفتند:
ترکیب نسبتا ثابت کاست ژنی کلاس ۲ اینتگرونها که در اکثر مواقع حاوی همان ۳ ژن مقاومت کلاسیک خود (مقاومت به استرپتوتریسین، مقاومت به استرپتومایسین/اسپکتینومایسین، مقاومت به تریمتوپریم) است
دیگر اینکه واکنش PCR با پرایمرهایی که در این پایان نامه و بر اساس منابع و کارهای قبلی برای کاست ژنی کلاس ۲، طراحی شده بود، با غلظت های متفاوت Mgcl2، و تحت شرایط مختلف دمایی، Set up نشد.
جدول۱۴-۳: ساخت محلول کار آماده جهت انجام PCR برای شناسایی کاست ژنی کلاس۱ اینتگرون
| مواد | مقادیر حجم برداشتی (میکرولیتر) برای یک واکنش ۵۰ میکرولیتری |
| آب مقطر(D.W) | ۵/۳۳ |
| ۱۰X Buffer | ۵ |
| Mgcl2(50mm) | ۵/۱ |
| Primer F (10µm) | ۲ |
| Primer F (10µm) | ۲ |
| dNTPs(10mm) | ۱ |
| DNA taq polymerase(5u/ml) | ۱ |
| جمع | ۴۶ |
* DNA استخراج شده با مقادیر ۴ میکرولیتر به هرتیوب واکنش اضافه گردید.
۱۴-۲-۳- انجام واکنش PCR برای شناسایی کاستهای ژنی اینتگرون کلاس ۱
پس از آماده سازی مخلوط اصلی بوسیله مخلوط کردن مواد آورده شده در جدول ۱۴-۳، در کنار یخ، وانجام یکبار سانتریفیوژ کوتاهمدت (به اصطلاح spin)، ۴۶ میکرولیتر از مخلوط اصلی همگن شده به هر میکروتیوب ۵/۰ میلی لیتری مخصوص واکنش PCR اضافه شد. سپس با اضافهکردن DNA استخراجی به میزان ۴ میکرولیتر به هر واکنش، میکروتیوبها آماده قرار گرفتن در دستگاه ترموسایکلر میشدند. برای اینکه ارزش نتایج حاصل از PCR قابل اعتماد باشد، در هر سری واکنش، کنترل مثبت و کنترل منفی در کنار دیگر نمونهها گذاشته میشد. در پایان به تمامی میکروتیوبهای PCR روغن معدنی (mineral oil) اضافهشده تا از تبخیر محلول همگن جلوگیری شده و ترکیب واکنش به هم نخورد. پس از آماده سازی و اطمینان از بستهبودن درب تمامی نمونهها، آنها در دستگاه ترموسایکربایوراد[۵۷] که از قبل برنامه خاص واکنش PCR (جدول ۸-۳) به آن داده شده، قرار میگرفتند.
پس از اتمام زمان واکنش، محصولات PCR به منظور تعیین وجود کاست ژنی و طول باندهای حاصله و الگوهای متفاوت کاستهای ژنی مورد بررسی واقع شدند. برای این منظور محصولات با بهره گرفتن از الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۱ درصد مورد آزمایش واقع شدند. انجام واکنش الکتروفورز همانند آنچه که در مورد ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ گفته شد، صورت گرفت. با این حال لازم به ذکر است که چون طبق اطلاعات منابع، وزن کاستهای ژنی به علت وجود ژنهای متفاوت سنگین است، بنابراین از ژل با درصد پایین‌تر (۱ درصد) استفاده شد وزمان الکتروفورز به ۶۰ دقیقه ارتقاء یافت تا باندهای سنگین به میزان کافی از هم فاصله بگیرند واختلاف طول آنها قابل تفکیک باشد.
۱۵-۲-۳- تعیین ترادف محصولات
پس از بررسی نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات کاستهای ژنی و تعیین تقریبی طول باندهای حاصل، الگوهای متفاوت کاستها مشخص گشت. در ادامه از هر الگوی متفاوت (طول باند متفاوت) یک نمونه به منظور تعیین ترادف و انجام سکانس[۵۸] از طریق شرکت ژن فن آوران به کشور کره جنوبی (شهر سئول) ارسال گردید. تا ژنهای مقاومت آنتی‌بیوتیکی موجود در کاستهای با طول متفاوت، شناسایی شوند. در پایان نتایج نهایی و استخراج شده حاصل از سکانس‌ها (تعیین ترادف) با بهره گرفتن از برنامه BLAST n موجود در سایت NCBI مورد جستجو قرار گرفت تا ژنهای مقاومت شناسایی شده با بهره گرفتن از اطلاعات بانک ژنی نیز مورد تأیید قرار گیرند.
۱۶-۲-۳- آزمون آماری
لازم به ذکر است که بررسی معناداری فراوانی ژن اینتگراز ۱ و اینتگراز ۲ و فراوانی حضور همزمان هر دو اینتگراز در جدایههای اشریشیا‌کولی در بین مراحل مختلف پرورش با بهره گرفتن از نرم افزار SPSS نسخه ۱۶ و با آزمایش آماری مربع کای[۵۹] انجام شد.
فصل چهارم: نتایج
۱-۴ نتایج جستجوی اینتگرونهای کلاس ۱ و ۲
پس از انجام آزمایش آنتی‌بیوگرام بر روی ۳۰۰ جدایه‌ی کلواکی که از سه مرحله نمونه‌گیری بدست آمده بودند، معلوم گشت که در مجموع ۷/۸۲ درصد از جدایه ها دارای مقاومت چندگانه بودند (همچنین ۸/۵۱ درصد جدایه ها دارای مقاومت گسترده و ۵/۲ درصد جدایه ها مقاومت آنتی بیوتیکی کامل داشتند). بالاترین میزان مقاومت های چندگانه در مرحله سوم نمونه گیری دیده شد بطوریکه ۸۵ درصد از جدایه های اشریشیا کولی بررسی شده در این مرحله دارای مقاومت چند گانه آنتی بیوتیکی بودند. میزان حضور مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در سه مرحله نمونه گیری در جدول ۱-۴ و نیز نمودار ۱-۴ آمده است.
جدول ۱-۴: مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز
| تعداد جدایه | فاقد مقاومت چندگانه (%) | مقاومت چندگانه (%) | مقاومت گسترده (%) | مقاومت کامل (%) | |
| مرحله اول | ۱۰۰ | ۱۹ | ۸۱ | ۵۴ | ۴ |
| مرحله دوم | ۱۰۰ | ۱۸ | ۸۲ | ۴۵ | ۲ |
| مرحله سوم | ۱۰۰ | ۱۵ | ۸۵ | ۴۵ | ۲ |
نمودار۱-۴: درصد مقاومت های چندگانه آنتی بیوتیکی در جدایه های اشریشیا کولی بدست آمده از مراحل مختلف نمونه گیری در گله های گوشتی اطراف شیراز.
پس از تعیین جدایههای دارای مقاومت آنتی‌بیوتیکی چندگانه، جدایه‌هایی که درجه بالاتری از مقاومت (قطر کمتر هاله عدم رشد) را نسبت به آنتیبیوتیکها نشان داده بودند، بررسی شده و از میان آنها تعداد ۱۳۹ نمونه انتخاب شدند که به ترتیب: ۳۸ نمونه مربوط به مرحله اول، ۵۵ نمونه مربوط به مرحله دوم و ۴۶ نمونه مربوط به مرحله سوم بودند. نتایج حاصل از PCR برای جستجوی ژن intI1 در این نمونهها به این صورت بود که از ۳۸ نمونه مرحله اول، ۲۶ نمونه (۴/۶۸%) مثبت و ۱۲ نمونه (۳/۳۱%) منفی بودند. از ۵۵ جدایه مرحله دوم، ۴۰ جدایه (۷/۷۲%) مثبت و ۱۵ جدایه (۳/۲۷%) منفی بودند. و از ۴۶ نمونه مرحله سوم، ۲۸ نمونه (۹/۶۰%) مثبت و ۱۸ نمونه (۱/۳۹%) منفی بودند (جدول ۲-۴ و نمودار ۲-۴). از نظر آماری، فراوانی حضور ژن اینتگراز ۱ بین زمان های مختلف پرورش اختلاف معنی دار نشان ندادند (P > 0.05).
جدول ۲-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ در جدایه های E. coli جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی
| مراحل نمونه گیری | تعداد (%) موارد مثبت | تعداد (%) موارد منفی | تعداد (%) کل |
| مرحله اول | ۲۶ (۴/۶۸%) | ۱۲ (۳/۳۱%) | ۳۸ (۱۰۰%) |
| مرحله دوم | ۴۰ (۷/۷۲%) | ۱۵ (۳/۲۷%) | ۵۵ (۱۰۰%) |
| مرحله سوم | ۲۸ (۹/۶۰%) | ۱۸ (۱/۳۹%) | ۴۶ (۱۰۰%) |
نمودار ۲-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۱ در جدایه های E. coli بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه.
نتایج حاصل از PCR برای جستجوی ژن intI2 درمراحل مختلف به این صورت بود که در مرحله اول، از ۳۸ نمونه، ۱ نمونه (۶/۲%) مثبت و ۳۷ نمونه (۴/۹۷%) منفی شد. از ۵۵ جدایه مرحله دوم، ۱۴ جدایه (۵/۲۵%) مثبت و ۴۱ جدایه (۵/۷۴%) منفی شد. و از ۴۶ نمونه مرحله سوم، ۱۴ نمونه (۴/۳۰%) مثبت و ۳۲ نمونه (۶/۶۹%) منفی شد (جدول ۳-۴ و نمودار ۳-۴). فراوانی حضور ژن اینتگراز ۲ بین زمان های مختلف پرورش اختلاف آماری معنی دار نشان دادند، به نحوی که فراوانی مرحله سوم و دوم پرورش نسبت به مرحله اول از میزان بیشتری برخوردار بود (P < 0.05).
جدول ۳-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۲ در جدایه های E. coli جداشده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی
| مراحل نمونه گیری | تعداد (%) موارد مثبت | تعداد (%) موارد منفی | تعداد (%) کل |
| مرحله اول | ۱ (۶/۲%) | ۳۷ (۴/۹۷%) | ۳۸ (۱۰۰%) |
| مرحله دوم | ۱۴ (۵/۲۵%) | ۴۱ (۵/۷۴%) | ۵۵ (۱۰۰%) |
| مرحله سوم | ۱۴ (۴/۳۰%) | ۳۲ (۶/۶۹%) | ۴۶ (۱۰۰%) |
نمودار ۳-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز ۲ در جدایه های E. coli بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه
از نظر حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ در جدایههای مورد آزمایش در این مطالعه، نتایج به این صورت بود که: از ۳۸ نمونه مرحله اول، تنها ۱ نمونه (۶/۲%) مثبت و ۳۷ نمونه (۴/۹۷%) منفی شد. از ۵۵ جدایه مرحله دوم، ۷ جدایه (۷/۱۲%) مثبت و ۴۸ جدایه (۳/۸۷%) منفی شد. و از ۴۶ نمونه مرحله سوم، ۴ نمونه (۷/۸%) مثبت و ۴۲ جدایه (۳/۹۱%) منفی شد (جدول ۴-۴ و
نمودار ۴-۴).
فراوانی حضورهمزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ بین زمان های مختلف پرورش در جدایه های مورد مطالعه، اختلاف آماری معنی داری نشان ندادند (P > 0.05).
جدول ۴-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ در جدایه های E. coli جدا شده در سه مرحله مختلف از جوجه های گوشتی
| مراحل نمونه گیری | تعداد (%) موارد مثبت | تعداد (%) موارد منفی* | تعداد (%) کل |
| مرحله اول | ۱ (۶/۲%) | ۳۷ (۴/۹۷%) | ۳۸ (۱۰۰%) |
| مرحله دوم | ۷ (۷/۱۲%) | ۴۸ (۳/۸۷%) | ۵۵ (۱۰۰%) |
| مرحله سوم | ۴ (۷/۸%) | ۴۲ (۳/۹۱%) | (۱۰۰%) |
* مواردی که فقط برای یکی از اینتگرازها مثبت بوده را نیز شامل میشود
نمودار ۴-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی حضور همزمان ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ در جدایه های E. coli بدست آمده طی مراحل مختلف نمونه‌گیری در این مطالعه
به طور کلی از تمام ۱۳۹ جدایه بدست آمده از مراحل مختلف ۹۴ نمونه (۶/۶۷%) اینتگراز ۱ مثبت (۴۵ نمونه (۴/۳۲%) منفی) و ۲۹ نمونه (۹/۲۰%) اینتگراز ۲ مثبت (۱۱۰ نمونه (۱/۷۹%) منفی) و ۱۲ نمونه (۶/۸%) از نظر حضور همزمان هر دو اینتگراز مثبت (۱۲۷ نمونه (۴/۹۱%) منفی) بودند (جدول ۵-۴ و نمودار ۵-۴). محصولات PCR حاصل از موارد مثبت ژنهای اینتگراز ۱ و ۲ به همراه نمونههای کنترل مثبت آن ژنها پس از انجام الکتروفورز در ژل آگارز در مقایسه با مارکر ۱۰۰ جفت بازی در تصویر ۱-۴ نمایش داده شده است.
جدول ۵-۴: تعداد (درصد) موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ و ژن اینتگراز۲ و حضور همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه
| ژن مورد بررسی | تعداد (%) موارد مثبت | تعداد (%) موارد منفی | مجموع (%) |
| اینتگراز ۱ | ۹۴ (۶/۶۷%) | ۴۵ (۴/۳۲%) | ۱۳۹ (۱۰۰%) |
| اینتگراز ۲ | ۲۹ (۹/۲۰%) | ۱۱۰ (۱/۷۹%) | ۱۳۹ (۱۰۰%) |
| هر دو اینتگراز | ۱۲ (۶/۸%) | ۱۲۷ (۴/۹۱%) | ۱۳۹ (۱۰۰%) |
نمودار ۵-۴: نمودار درصد موارد مثبت و منفی ژن اینتگراز۱ و ژن اینتگراز۲ و حضور همزمان هر دو ژن اینتگراز در تمام جدایه های E. coli مورد بررسی در این مطالعه
تصویر۱-۴: تصویر ژل الکتروفورز، چاهک ۱ مارکر ۱۰۰ جفت بازی است. چاهک ۲ نمونه کنترل منفی، چاهک ۳ کنترل مثبت ژن اینتگراز ۲ با طول۴۰۳ bp، چاهک ۴ نمونه کنترل مثبت ژن اینتگراز ۱ با طول ۵۶۴ bp، چاهکهای ۵و۶ نمونههای فاقد اینتگراز ۱ یا ۲، چاهکهای ۷و۸و۹و۱۲ نمونههای دارای ژن اینتگراز ۱، چاهکهای ۱۰و۱۱ نمونههای دارای هر دو ژن اینتگراز، و چاهک ۱۳ نمونه‌ی دارای ژن اینتگراز ۲ میباشند
۲-۴ نتایج بررسی کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها
پس از انجام PCR با پرایمرهای مخصوص کاست کلاس۱ بر روی نمونه‌هایی که دارای ژن اینتگراز ۱ بودند. الگوهای متفاوت باندهای محصولات PCR با الکتروفورز روی ژل آگارز معلوم شد (تصویر۲-۴ و تصویر ۳-۴).
تصویر ۲-۴: الگوی باندهای محصولات PCR کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها با طول متفاوت پس از الکتروفورز روی ژل آگارز
کاستهای ژنی کلاس ۱ اینتگرونها طول‌های متفاوتی داشتند که از حدود ۱۵۰۰ جفت باز تا بالاتر از ۳۰۰۰ جفت باز متغیر بود. به علت عدم درجه بندی مارکر bp100در فاصله ۱۵۰۰ تا ۳۰۰۰ جفت باز و همچنین عدم توانایی این مارکر در تعیین طول مقادیر بالاتر از ۳۰۰۰ جفت باز، تعیین طول دقیق باندهای حاصل از کاست ژنی اینتگرون کلاس۱ امکان‌پذیر نبود و تنها اندازه تقریبی آنها تخمین زده شد. با این وجود، اختلاف طول آنها کاملا واضح بود .
تصویر ۳-۴: الگوی باندهای محصولات PCR کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها با طول متفاوت پس از الکتروفورز روی ژل آگارز
۳-۴ نتایج تعیین توالی کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها
از محصولات PCR کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها که طول متفاوت داشتند نمونه‌هایی برای توالی یابی و تعیین محتوای ژنتیکی به شهر سئول در کره‌ی جنوبی، ارسال گشت. اطلاعات محصولات کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها که برای تعیین توالی انتخاب و ارسال شدند درجدول۶-۴ آمده است.
جدول ۶-۴: کد نمونه، طول کاست ژنی و ژنهای موجود در کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها در محصولات PCR تعیین ترادف شده
| ژنهای موجود در کاست | طول کاست ژنی (جفت باز) | کد نمونه |
| (aadA1) & (dfrA1) | ۱۵۸۶ | C117 |
| (dfrA1) & (aadA1) | ۱۵۸۶ | C137 |
| (aadA5) & (dfrA17) | ۱۶۶۴ | C144 |
| & (aadA2) (orfF)& (dfrA12) | ۱۹۱۳ | C147 |
| & (aadA1)(dfrA1) | ۱۵۸۶ | C177 |
| & (aadA5) (dfrA17) | ۱۶۶۴ | C200 |
| (dfrA1) & (aadA1) | ۱۵۸۶ | C205 |
| (dfrA17) & (ereA1) & (aadA2) | ۳۲۰۰ ~ | C309 |
| (dfrA12) & (orfF) & (aadA2) | ۱۹۱۳ | C326 |
| (dhfr1) & (aadA1) | ۱۵۸۶ | C331 |
| (dfrA5) & (ereA2) | ۲۰۹۷ | C335 |
| (dfrA12) & (orfF) & (aadA2) | ۱۹۱۳ | C345 |
| (dfrA1) & (aadA1) | ۱۵۸۶ | C354 |
| (dfrA5) & (ereA2) | ۲۰۹۷ | C369 |
| (dfrA1) & (aadA1) | ۱۵۸۶ | C377 |
| (dfrA17) & (ereA1) & (aadA2) | ۳۲۰۰ ~ | C383 |
در جدول فوق اسامی ژنهای موجود در کاست به صورت مخفف آمده که نام کامل آنها به صورت زیر می باشد:
| (dfrA) | dihydrofolate reductase |
| (aadA) | aminoglycoside adenylyltransferase |
| (ereA) | erythromycin esterase |
| (orfF) | hypothetical protein |
ژن dfrA انواع گوناگونی دارد که تیپهای ۱ و ۵ و ۱۲ و ۱۷ آن در برخی نمونههای سکانس شده ما وجود داشت. ژن aadA هم متنوع است و تیپهای ۱ و۲ و۵ آن در تعدادی از نمونههای مذکور یافت شد. ژن ereA نیز انواعی دارد که تیپ ۱ و ۲ آن در تعدادی از جدایههای تعیین ترادف شده، موجود بود. همچنین ژن orfF در ۳ تا از جدایههای توالی یابی شده یافت شد (جدول ۶-۴).
فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری
افزایش استفاده ار آنتی‌بیوتیک در سراسر جهان به عنوان بخشی جدایی ناپذیر از صنعت تولید دام و طیور به منظور درمان و جلوگیری از بیماری های عفونی باکتریایی و به عنوان افزاینده‌ی رشد در مقادیر کمتر از دوز درمانی در خوراک، منجر به معضل توسعه‌ی مقاومت آنتی‌بیوتیکی در باکتریها در طول سالهای گذشته شده است (آپاتا، ۲۰۰۹).
مصرف آنتی بیوتیک های مختلف در پرورش گله های گوشتی، عمومیت بسیاری یافته است و این در حالی است که در موارد زیادی ضرورت کافی برای مصرف دارو وجود ندارد و در موارد بسیاری نیز داروی مناسبی انتخاب نمی شود. مصرف بی قاعده و غیر اصولی از آنتی بیوتیک ها در صنعت طیور به منظور پیشگیری، درمان و نیز جهت بهبود ضریب تبدیل، بدون رعایت غلظت و مدت زمان کافی جهت تأثیر آنها، علاوه بر هزینه هنگفتی که بیهوده به هدر می دهد، می تواند عواقب وخیمی نیز برای گله تحت درمان و حتی صنعت طیور، سلامت انسان و محیط زیست بدنبال داشته باشد. ظهور و تکثیر میکروارگانیسم های مقاوم به دارو را می توان از بدترین عواقب مصرف نادرست داروها دانست (صدرزاده، ۱۳۹۱).
انتقال احتمالی باکتری های مقاوم از فرآورده‌های طیور به جمعیت انسانی ممکن است از طریق مصرف و یا دست زدن به گوشت آلوده با این باکتریها رخ دهد (ون دن بوگارد و استابرینگ، ۲۰۰۰). باکتری های مقاوم به محض به دست آوردن مقاومت، می‌توانند در روده انسان کلونیزه و ساکن شوند و ژنهای کدکننده مقاومت به آنتیبیوتیکها می‌توانند به سایر باکتریهای متعلق به فلور نرمال انسان منتقل شوند و در نتیجه درمان موثر عفونت های باکتریایی را به خطر بیاندازند (د لینر، ۲۰۰۵). باکتریهای با منشاء حیوانی که حامل مقاومت به عوامل ضد میکروبی حیاتی در درمان انسانها (به عنوان مثال، آمینوگلیکوزیدها، فلوروکینولون ها و سفالوسپورین های نسل سوم و چهارم) می باشند، از خاصه نگرانی‌های مهم در سالهای اخیر هستند (هامروم و هیوئر، ۲۰۰۹).
در پژوهش حاضر از ۳۰۰ جدایه‌ی E. coli (پس از انجام آنتی‌بیوگرام برای سنجش مقاومت و حساسیت جدایه‌ها نسبت به آنتیبیوتیکهای مورد آزمایش) معلوم گشت که ۷/۸۲% جدایه‌ها، مقاومت چندگانه دارویی داشتند، که به ترتیب ۸۱% ، ۸۲% و ۸۵% مربوط به مراحل اول و دوم و سوم نمونه‌گیری بودند. در مطالعه‌ای که توسط فورچولا و همکاران در سال ۲۰۱۰ در کانادا صورت گرفت، از مجموع ۷۲ جدایه‌ی جمع آوری شده از فارم‌های صنعتی و ۲ فارم کنترل که برای آنتیبیوتیکهای آموکسی‌سیلین، پنی سیلین، سفتیوفور، اریترومایسین، تایلوزین، کلیندامایسین، اسپکتینومایسین، استرپتومایسین، جنتامایسین، نئومایسین، اکسی تتراسایکلین، تتراسایکلین، انروفلوکساسین، سارافلوکساسین، نووبیوسین، سولفادیمتوکسین، سولفادیازول، تری متوپریم سولفامتوکسازول مورد آزمایش قرار گرفتند، تمام جدایههای (۱۰۰%) فارم‌های صنعتی مقاومت چندگانه به حداقل ۷ آنتی‌بیوتیک را نشان دادند (فورچولا و همکاران، ۲۰۱۰). در شهرکرد با بهره گرفتن از تکنیک PCR میزان توزیع ژنهای مقاومت آنتی بیوتیکی در۵۷ جدایه E. coli بدست آمده از گوشت ماکیان بررسی شد که ۹۱/۶۴%سویه ها مقاومت آنتی بیوتیکی چندگانه داشتند (ممتاز و همکاران، ۲۰۱۲). رجائیان و همکاران در سال ۲۰۰۳ مقاومت آنتی بیوتیکی برخی از عوامل باکتریایی متداول جدا شده از لاشه های جوجه های گوشتی بیمار را در مرغداری های اطراف شیراز بررسی کردند. جدایه های اشریشیا کولی بدست آمده در مطالعه آنها مقاومت بسیار بالایی را نسبت به آنتی بیوتیک های مختلف از خود نشان دادند. بطوریکه مقاومت بالای ۷۰ درصد در برابر آنتی‌بیوتیک هایی مانند آموکسی‌سیلین، پنی‌سیلین، اریترومایسین، تتراسیکلین، تایلوزین و فلومکوئین دیده شد. زهرایی صالحی و فراشی بناب نیز در سال ۲۰۰۶ مقاومت های آنتی بیوتیکی بالایی را در جدایه های اشریشیا کولی بدست آمده از ماکیان مبتلا به کلی باسیلوز در استان آذربایجان شرقی گزارش نموده اند. بطوریکه مقاومت های های بالای ۷۰ درصد علیه نئومایسین، استرپتومایسین، تتراسیکلین ها، اریترومایسین، فلومکوئین، نالیدیکسیک اسید، انروفلوکساسین و سولتریم دیده شد. خوشخو و پیغمبری نیز در سال ۲۰۰۵ با جداسازی اشریشیا کولی های بدست آمده از لاشه های مشکوک به کلی باسیلوز در استان تهران و انجام آزمایش حساسیت میکروبی، مقاومت های بالایی را علیه اکثر عوامل ضدمیکروبی گزارش کردند.
نتایج حاصل از مطالعه حاضر به همراه اطلاعات قبلی بدست آمده از مناطق مختلف ایران، موید این مطلب است که افزایش مقاومت های آنتی بیوتیکی به یک چالش مهم در صنعت طیور ایران تبدیل شده است. که این نشانگر این است که نگرانی‌های جهانی در مورد باکتریهای دارای مقاومت چندگانه کاملا منطقی است و تایید کننده اظهارات پرورش‌دهندگان طیورگوشتی مبنی بر اثر بخش نبودن تعداد زیادی از آنتیبیوتیکها در طی سالهای گذشته میباشد.
همانطور که مشاهده میشود حضور مقاومت چندگانه دارویی در جدایههای این مطالعه از همان ابتدا در جوجه‌های یک روزه بالاست و در طول دوره پرورش با وجود افزایش از ۸۱% به ۸۵% ازلحاظ آماری معنی‌دار نیست (P>0.05). از جمله دلایل این مسئله این است که بسیاری از فاکتورهای ایجاد کننده مقاومت که در اثر مصرف بی‌رویه و نابجای آنتی‌بیوتیک ایجاد شده‌اند حتی با حذف آنآنتی بیوتیک خاص از استفاده ی درمانی ، به بقاء خود ادامه می دهند (بیگر و همکاران، ۱۹۹۹).
همانطور که پیش‌تر اشاره شد، مقاومت آنتی‌بیوتیکی در باکتریها می‌تواند از طریق مکانیسم های ذاتی یا اکتسابی بدست آید. مکانیسم‌های ذاتی اشاره به ژنهایی دارد که به طور طبیعی بر روی کروموزوم میزبان وجود دارند مثل ژن کد کننده بتا-لاکتاماز در باکتریهای گرم منفی و بسیاری از پمپ‌های انتشار به خارج[۶۰] در باکتریهای واجد مقاومت چندگانه. مکانیسم‌های اکتسابی شامل: جهش در ژن (های) هدف آنتی‌بیوتیک (وراثت عمودی)، و انتقال فاکتورهای مقاومت از طریق پلاسمیدها، باکتریوفاژها، ترانسپوزونها و اینتگرونها (انتقال افقی) میباشد. این اکتساب مقاومت بوسیله انتقال افقی از طریق تبادل عناصر ژنتیکی متحرک صورت میپذیرد. به طور کلی، این تبادل از طریق فرآیندهای ترانسداکسیون (از طریق باکتریوفاژ)، الحاق[۶۱] (از طریق پلاسمیدها و ترانسپوزونهای الحاقی) و ترانسفورماسیون (از طریق الحاق عنصر ژنتیکی مقاومت با DNA کروموزومی یا پلاسمید یا سایر DNA ها) صورت می‌گیرد (لوی و مارشال، ۲۰۰۴).
به طور معمول انتقال افقی ژنهای مقاومت به عنوان یک علت عمده برای تسهیل گسترش سریع مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک در میکروب ها در نظر گرفته شده است. در سال های اخیر، نقش اینتگرونها به عنوان عناصر ژنتیکی متحرک که نقش محوری در انتقال افقی مقاومت به آنتیبیوتیکها بازی می‌کنند، به خوبی مورد مطالعه قرار گرفته و مستندسازی شده است. در واقع اینتگرونها عناصر ژنتیکی متحرکی هستند که با گرفتن، تبادل و بیان ژنهای جاسازی شده درکاست‌های ژنی سبب گسترش ژنهای مقاومت در میان باکتریها می‌شوند. با این حال، تا امروز، اغلب تحقیقات موجود و مطالعات انجام شده در زمینه اینتگرون، بر روی کلاس ۱ اینتگرونها در میکروارگانیسم های گرم منفی متمرکز بوده است (یو و همکاران، ۲۰۱۳).
از ۱۳۹ جدایه‌ی اشریشیا‌کولی دارای مقاومت چندگانه جدا شده از طیورکه در این مطالعه آزمون PCR (برای بررسی حضور یا عدم حضور اینتگرون) بر روی آنها انجام شد، ۶/۶۷% آنها (۹۴ جدایه) دارای اینتگرون کلاس ۱ (ژن اینتگراز ۱) و ۹/۲۰% آنها (۲۹ جدایه) دارای اینتگرون کلاس ۲ (ژن اینتگراز ۲) و ۶/۸% (۱۲ جدایه) دارای هر دو کلاس اینتگرون بودند.
همچنین بر اساس نتایج حاصل از توالی‌یابی محصولات PCR نمونه‌هایی که دارای الگوی باندی با طول متفاوت در الکتروفورز روی ژل آگارز بودند، ۴ نوع ژن متفاوت در کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونهای موجود در این نمونهها شناسایی شد که عبارتند از:
۱) dfrA (dihydrofolate reductase) که سبب مقاومت به تریمتوپریم میشود. که تیپ ۱ و۵ و ۱۲ و ۱۷ آن (dfrA1، dfrA5، dfrA12، dfrA17) در نمونههای مختلف حضور داشت.
۲) aadA (aminoglycoside adenylyltransferase) که سبب مقاومت به استرپتومایسین/ اسپکتینومایسین میشود. تیپهای ۱ و۲ و۵ آن (aadA1، aadA2، aadA5) در نمونههای مختلف موجود بود.
۳) ereA (erythromycin esterase) که سبب مقاومت به اریترومایسین میشود. تیپهای ۱ و ۲ آن (ereA1 و ereA2) در ۲ تا از نمونهها حضور داشت.
۴) orfF (hypothetical protein) که سبب ایجاد مقاومت شناخته شده‌ای(تا به امروز) نمی‌شود (اطلاعات ترتیب و آرایه‌ی[۶۲] این ژنها در کاست ژنی کلاس ۱ اینتگرونها به همراه طول کاست ژنی نمونهها در جدول ۶-۴ آورده شده است).
لازم به ذکر است که تا سال ۲۰۰۹ از ژن aadA تیپهای ۱، ۲، ۴، ۵، ۶، ۷، ۹،۱۰،۱۱،۱۳،۱۶ و ۲۴، از ژن dfrA تیپهای ۱، ۵، ۶، ۷، ۱۲، ۱۴، ۱۵، ۱۶، ۱۷، ۲۱، ۲۲، ۲۵، ۲۷، ۲۸، ۲۹، ۳۰ و ۳۱، از ژنهای ereA تنها ۲ تیپ ۱ و ۲ شناخته شده‌اند (پارتریج و همکاران، ۲۰۰۹).
مطالعات انجام شده در مناطق مختلف دنیا بر روی نمونههای اشریشیا‌کولی جدا شده از ماکیان به منظور شناسایی اینتگرونها نتایج نسبتا مشابهی را نشان داده‌اند. در ایالت جورجیای آمریکا، باس و همکاران در سال ۱۹۹۹ در طی پژوهشی متوجه شدند ۳۶% (۱۰۰ عدد) از جدایههای اشریشیا‌کولی پاتوژن جدا شده از ماکیان بیمار مقاومت چندگانه آنتی بیوتیکی به تتراسایکلین، اکسی‌تتراسایکلین، استرپتومیسین، سولفونامید و جنتامیسین داشتند، ۶۳% آنها از لحاظ حضور کلاس ۱ اینتگرونها (با روش PCR) مثبت بودند که همگی دارای ژن مقاومت به استرپتومایسین/ اسپکتینومایسین aadA1 بودند و چون معین شد تعداد بسیار زیادی از این اینتگرونها جزئی از ترانسپوزون Tn21 بودند، بنابراین در بررسی‌های بیشتر معلوم شد که این اینتگرونها حاوی ژن merA (mercury reductase) کدکننده مقاومت به ترکیبات جیوه نیز بوده اند (باس و همکاران، ۱۹۹۹).
طی پژوهشی در چین، یانگ و همکاران در سال ۲۰۰۴ در ۵۹% نمونههای E. coli جدا شده از مرغان گوشتی، کلاس ۱ اینتگرونها را شناسایی کردند که نمونههای مختلف دارای ژنهای dhfr1، aadA1،dhfr17، aadA2 و dhfr13 با ترکیب و آرایه‌های متنوع بودند (یانگ و همکاران، ۲۰۰۴). در تحقیقی دیگر در ایالت جورجیای آمریکا، اسمیت و همکاران در سال ۲۰۰۶ شیوع بالایی از کلاس ۱ اینتگرونها را در جدایههای طیور گوشتی گزارش کردندکه اکثرا حاوی aadA1 ژن مقاومت به استرپتومایسین بودند. لازم به ذکر است که بیش از ۷۵% جدایههای اشریشیا‌کولی بدست آمده از مزارع صنعتی طیور در مطالعه آنها مقاومت چندگانه دارویی داشتند (اسمیت و همکاران، ۲۰۰۷). صوفی و همکاران (۲۰۱۰) تعداد ۱۶۶جدایه‌ی E. coli بدست آمده از گوشت طیور در تونس را مورد بررسی قرار دادند، که نتایج آنتی بیوگرام ۱۳ آنتی‌بیوتیک حاکی از ۹۰% مقاومت چندگانه بود. در ضمن کلاس ۱ و۲ اینتگرونها در ۸/۵۴% این جدایه ها تشخیص داده شدند. کلاس ۱ در ۶/۵۰% ، کلاس ۲ در ۲/۴% و حضور همزمان هر دو کلاس در ۳% این ۱۶۶ نمونه وجود داشت. در مطالعه این پژوهشگران ژنهای، aadA (تیپهای ۱ و ۲ و ۵)،dfrA ( تیپهای ۱ و ۱۲ و ۱۴ و۱۷)، orfF وتعدادی ژنهای دیگر در ارتباط با کلاس ۱ اینتگرونها شناسایی شد.۷۳ % سویه های اینتگرون مثبت، حداقل به پنج خانواده ی مختلف آنتی بیوتیکی مقاومت نشان دادند (صوفی و همکاران، ۲۰۱۱). در مطالعه‌ای که توسط کارچمارچیک وهمکاران در سال ۲۰۱۱ در ایرلند انجام شد جدایه های E. coli بدست آمده از حیوانات بستری شده در بیمارستان به منظور تشخیص مقاومت، تحت بررسی PCR و تعیین توالی DNA قرار گرفتند که کلاس ۱ اینتگرونها در ۶/۹۴% سویه ها وکلاس ۲ اینتگرونها در ۵/۱۳%سویه ها شناسایی شدند که ژنهای موجود در کلاس ۱ اکثرا شامل ژنهای مقاومت به تریمتوپریم، آمینوگلیکوزیدها و بتا-لاکتام‌ها بودند و کلاس ۲ نیز دارای ژنهای مقاومت به تریمتوپریم، استرپتوتریسین، استرپتومایسین/ اسپکتینومایسین بود (کارچمارچیک و همکاران، ۲۰۱۱).
نتایج حاصله در این مطالعه و اطلاعات موجود از سایر نقاط جهان (که در بالا به آنها اشاره شد) همگی موید این نکته هستند که اینتگرونهای کلاس ۱ و ۲ در جدایههای اشریشیا‌کولی طیور گوشتی با فراوانی قابل توجهی یافت می‌شوند (فراوانی بالای ۵۰%). همچنین فراوانی کلاس ۱ اینتگرونها به طور معناداری بیشتر از کلاس ۲ اینتگرونها میباشد.
بر اساس نتایج این پایان نامه کلاس ۱ اینتگرون ها شامل ژنهای مقاومت به ۳ خانواده آنتی‌بیوتیکی ماکرولیدها (اریترومایسین)، آمینوگلیکوزیدها (استرپتومایسین) و مهارکننده‌های سنتز اسید فولیک (تریمتوپریم سولفا) میباشد که این موضوع موید ارتباط بین حضور اینتگرونها و وجود مقاومت‌های چندگانه دارویی است. در مطالعه‌ی صوفی و همکاران (۲۰۱۰) و کارچمارچیک و همکاران (۲۰۱۱) نیز ارتباط بین وجود اینتگرونها و مقاومت‌های چندگانه دارویی به وضوح دیده میشود. به علاوه کلاس ۲ اینتگرونها نیز علیرغم عدم شناسایی ژنهای مقاومتشان در این مطالعه، به شکل کلاسیک و تقریبا ثابت دارای سه ژن dfrA1، sat1 ، aadA1میباشد که سبب مقاومت به تریمتوپریم، استرپتوتریسین، استرپتومایسین/ اسپکتینومایسین میشود و البته می‌تواند حاوی ژنهای دیگری نیز در اثر نوترکیبی اینتگراز ۱ و ۳ باشد.
به طور کلی بیش از ۷۰ ژن (کاست ژنی) در ارتباط با کلاس ۱ اینتگرونها شناخته شده که می تواند سبب القا مقاومت به تمام بتا-لاکتامهای شناخته شده، تمام آمینوگلیکوزیدها، کلرآمفنیکل، تریمتوپریم،استرپتوتریسین، ریفامپین، اریترومایسین، فسفومایسین، لینکومایسین، ترکیبات چهارتایی آمونیوم شود (رو- مگنوس و مازل، ۲۰۰۲؛ فلوت و اشمیتز، ۲۰۰۴؛ مازل، ۲۰۰۶).
با این وجود بسیاری از فاکتورهای مقاومت به آنتیبیوتیکهای مختلف می‌توانند مستقل از اینتگرونها منتقل شوند چرا که سیستم‌های مقاومت چندگانه دارویی مستقل از اینتگرونها در باکتریهای خانواده‌ی انتروباکتریاسه شناسایی شده اند. یکی از این موارد مقاومت به استرپتومایسین است. گرچه مقاومت به آن می‌تواند از طریق اینتگرون و ژن aadA باشد اما مکانیسم غیر وابسته به اینتگرون نیز برای آن وجود دارد که یا از طریق جهش کروموزومی یا به طور غالب از طریق ژنهای strA و strB (کد کننده آمینوگلیکوزید فسفوترانسفراز) که سبب مقاومت به استرپتومایسین می‌شوند، رخ می‌دهد. این دو ژن با هم ارتباط ژنتیکی داشته و مجاور یکدیگر قرار دارند (strA-strB) و این ترکیب در طیف وسیعی از پلاسمیدها و ترانسپوزون Tn5393 شناسایی شده است و در انسان، حیوانات و خاک یافت شده است. همچنین ژن sul2 در باکتریهای گرم منفی روده‌ای سبب مقاومت به سولفونامیدها، به طور مستقل از اینتگرونها می‌شوند. که این مقاومت می‌تواند نتیجه‌ی جهش در ژن dhps یا به علت ژنهای sul1، sul2، sul3 که از طریق پلاسمید منتقل می‌شوند، باشد. مثال دیگر ژنهایtet هستندکه سبب مقاومت به تتراسایکلین‌ها می‌شوند که تا کنون کلاسهای A، B، C، D، E، F، G از ژن tet در ارتباط با سویه‌های مختلف اشریشیا‌کولی شناسایی شده است که کد کننده پمپ‌های انتشار به خارج از سلول هستند و به صورت مستقل از اینتگرون و بوسیله‌ی پلاسمید و ترانسپوزون و یا حتی کروموزوم منتقل می‌شوند. مورد دیگر سیستم مقاومت چندگانه دارویی کروموزومی (جایگاه مار[۶۳]) میباشد که در اشریشیا‌کولی و سالمونلا شناسایی شده و سبب مقاومت به آنتی‌بیوتکهای بتا-لاکتام، کلرآمفنیکل، تتراسایکلین و غیره میشود، همچنین سبب مقاومت به ضد عفونی‌کننده‌ها و حلال‌های شیمیایی نیز میگردد. حالت بعدی، مکانیسم‌های مقاومت متقاطع (ژن floR) میباشند. این ژن سبب مقاومت به هر دو آنتی‌بیوتیک کلرآمفنیکل و فلورفنیکل میشود که برای اولین بار در عامل بیماریزای ماهی‌ها (پاستورلا) یافت شد اما پس از آن ژنهای متشابه در سویه‌های اشریشیا‌کولی و سالمونلای جدا شده از حیوانات یافت شد. این ژن سبب رمزگردانی یک پروتئین گذرنده از غشاء[۶۴] میشود که سبب انتشار آنتی‌بیوتیک به خارج از سلول شده و واسطه‌ی مقاومت غیر آنزیمی به کلرآمفنیکل و فلورفنیکل میگردد. استفاده از کلرامفنیکل ممکن است سبب القای مقاومت متقاطع به فلورفنیکل در باکتریهای پاتوژن از طریق ژن floR شود. مطالعات بر روی جدایههای اشریشیا‌کولی حیوانی حضور این ژن در پلاسمید و کروموزوم را با سایر عناصر ژنتیکی متحرک مثل ترانسپوزون و اینتگرون ارتباط داده‌اند، یعنی این ژن، هم مستقل از اینتگرون و هم وابسته به اینتگرون منتقل میشود (ونتورینی، ۲۰۱۱).
از آنچه در بالا گفته شد اینطور نتیجه گیری میشود که گرچه بسیاری از ژنهای مقاومت بوسیله‌ی اینتگرونها منتقل می‌شوند اما بسیاری از فاکتورهای مقاومت می‌توانند به صورت مستقل از اینتگرون انتقال یابند که انتقال ژنهای مقاومت از طریق پلاسمید و ترانسپوزون از آن دسته میباشند. به علاوه برخی از فاکتورهای مقاومت در کروموزوم‌ها نیز حضور دارند. نکته‌ی قابل توجه آن است که برخی از ژنهای مقاومت می‌توانند هم بوسیله اینتگرون و هم مستقل از آن منتقل شوند که تمامی این موارد موید این موضوع است که گرچه حضور اینتگرونها ارتباط قوی و اثبات شده‌ای با مقاومت‌های چندگانه دارویی دارد اما مقاومت به برخی از آنتیبیوتیکهای مورد آزمایش درمورد سویه‌های دارای مقاومت چندگانه در این مطالعه و سایر مطالعات مشابه که قبلا ذکر شد، در اثر فاکتورهای مقاومت منتقل شونده به صورت مستقل از اینتگرونها میباشد. این پدیده می‌تواند توجیهی باشد برای ایجاد مقاومت آنتی‌بیوتیکی چندگانه علی رغم فقدان حضور ژن مقاومت مربوطه در کاستهای ژنی اینتگرونها.
در پژوهش حاضر نیز همانگونه که در بالا اشاره شد از ۳۰۰ جدایه‌ی E. coli (پس از انجام آنتی‌بیوگرام برای سنجش مقاومت و حساسیت جدایه‌ها نسبت به آنتیبیوتیکهای مورد آزمایش) معلوم گشت که ۷/۸۲% جدایه‌ها، مقاومت چندگانه دارویی داشتند، در حالی که تنها در مجموع ۹/۷۹% جدایههای مورد آزمایش (۱۳۹ عدد دارای مقاومت چندگانه) دارای اینتگرونهای کلاس ۱ و (یا) ۲ بودند.
همچنین در این مطالعه بین فراوانی ژن اینتگراز ۱ و۲ و حضور همزمان هر دو اینتگراز بین مراحل مختلف نمونه گیری مقایسه انجام شد و معناداری آن بررسی شد، که تا کنون در مطالعات دیگر انجام نگرفته بود. براساس نتایج این مطالعه، فراوانی ژن اینتگراز ۱ در مراحل اول تا سوم به ترتیب ۴/۶۸% و ۷/۷۲% و ۹/۶۰% بود که با وجود متفاوت بودن اعداد، تغییر آنها از لحاظ آماری معنی‌دار نبود و فراوانی اینتگرون کلاس ۱ همواره در طول دوره بالا بوده است.
فراوانی ژن اینتگراز ۲ در مراحل اول تا سوم به ترتیب ۶/۲% و ۵/۲۵% و ۴/۳۰% بدست آمد که یک روند افزایشی داشت اما فراوانی آن در طی مراحل دوم و سوم به طور معناداری بیشتر از مر حله اول بود.
همچنین فراوانی حضور همزمان هر دو اینتگراز بین مراحل اول تا سوم به ترتیب ۶/۲% ، ۷/۱۲% و۷/۸% بود که تغییرات آن معنی دار نبود زیرا درصد عمده فراوانی مربوط به اینتگراز کلاس ۱ میباشد که فراوانی آن هم تغییرات معناداری نداشت.
فهرست منابع
صدرزاده، اوستا. مدیریت پیشگیری از بیماری های طیور:(جوجه های گوشتی)، انتشارات گرمسار،دانشگاه آزاد اسلامی، ویرایش دوم ،۱۳۹۱، صفحات۷۰۸- ۷۰۱
Alekshun MN and Levy SB (2007). Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. ۱۲۸: ۱۰۳۷-۱۰۵۰٫
Amábile-Cuevas CF and Chicurel ME (1992). Bacterial plasmids and gene flux. Cell. ۷۰: ۱۸۹-۱۹۹٫
Apata D (2009). Antibiotic resistance in poultry. International Journal of Poultry Science. ۸: ۴۰۴-۴۰۸٫
Aryal S (2001). Antibiotic Resistance: A Concern to Veterinary and Human Medicine. Nepal Agriculture Research Journal. ۴: ۶۶-۷۰٫
Babic M, Hujer AM and Bonomo RA (2006). What’s new in antibiotic resistance? Focus on beta-lactamases. Drug Resistance Updates. ۹: ۱۴۲-۱۵۶٫
Bagcigil FA, Moodley A, Baptiste KE, Jensen VF and Guardabassi L (2007). Occurrence, species distribution, antimicrobial resistance and clonality of methicillin-and erythromycin-resistant staphylococci in the nasal cavity of domestic animals. Vet Microbiol. ۱۲۱: ۳۰۷-۳۱۵٫
Bager F, Aarestrup FM, Madsen M and Wegener HC (1999). Glycopeptide resistance in Enterococcus faecium from broilers and pigs following discontinued use of avoparcin. Microb Drug Resist. ۵: ۵۳-۵۶٫
Barnes H, Nolan L and Vaillancourt J (2008a). Colibacillosis, p 691–۷۳۲٫ Diseases of poultry, 12th ed Blackwell Publishing, Ames, IA.
Barraud O, Baclet M-C, Denis F and Ploy M-C (2010). Quantitative multiplex real-time PCR for detecting class 1, 2 and 3 integrons. J Antimicrob Chemother. ۶۵: ۱۶۴۲-۱۶۴۵٫
Bass L, Liebert CA, Lee MD, Summers AO, White DG, Thayer SG and Maurer JJ (1999). Incidence and characterization of integrons, genetic elements mediating multiple-drug resistance, in avianEscherichia coli. Antimicrob Agents Chemother. ۴۳: ۲۹۲۵-۲۹۲۹٫
Bettelheim KA (1994). Biochemical characteristics of Escherichia coli.
Bissonnette L and Roy P (1992). Characterization of In0 of Pseudomonas aeruginosa plasmid pVS1, an ancestor of integrons of multiresistance plasmids and transposons of gram-negative bacteria. J Bacteriol. ۱۷۴: ۱۲۴۸-۱۲۵۷٫
Box AT, Mevius DJ, Schellen P, Verhoef J and Fluit AC (2005). Integrons in Escherichia coli from food-producing animals in The Netherlands. Microb Drug Resist. ۱۱: ۵۳-۵۷٫
Brown HJ, Stokes H and Hall RM (1996). The integrons In0, In2, and In5 are defective transposon derivatives. J Bacteriol. ۱۷۸: ۴۴۲۹-۴۴۳۷٫
Cambray G, Guerout A-M and Mazel D (2010). Integrons. Annu Rev Genet. ۴۴: ۱۴۱-۱۶۶٫
Cameron FH, Obbink DJG, Ackerman VP and Hall RM (1986). Nucleotide sequence of the AAD (2′) aminoglycoside adenylyltransferase determinant aadB. Evolutionary relationship of this region with those surrounding aadA in R538-1 and dhfrll in R388. Nucleic Acids Res. ۱۴: ۸۶۲۵-۸۶۳۵٫
Carattoli A (2001). Importance of integrons in the diffusion of resistance. Vet Res. ۳۲: ۲۴۳-۲۵۹٫
Christina C, Minah K and Harold S (1998). Binding of the purified integron DNA integrase Intl1 to integron-and cassette-associated recombination sites. Mol Microbiol. ۲۹: ۴۷۷-۴۹۰٫
Chu Y-W, Chu M-Y, Luey K-Y, Ngan Y-W, Tsang K-L and Kam K-M (2004). Genetic relatedness and quinolone resistance of Campylobacter jejuni strains isolated in 2002 in Hong Kong. J Clin Microbiol. ۴۲: ۳۳۲۱-۳۳۲۳٫
Cohen ML (2000). Changing patterns of infectious disease. Nature. ۴۰۶: ۷۶۲-۷۶۷٫
Collis CM, Grammaticopoulos G, Briton J, Stokes H and Hall RM (1993). Site‐specific insertion of gene cassettes into integrons. Mol Microbiol. ۹: ۴۱-۵۲٫
Collis CM and Hall RM (1992a). Gene cassettes from the insert region of integrons are excised as covalently closed circles. Mol Microbiol. ۶: ۲۸۷۵-۲۸۸۵٫
Collis CM and Hall RM (1992b). Site-specific deletion and rearrangement of integron insert genes catalyzed by the integron DNA integrase. J Bacteriol. ۱۷۴: ۱۵۷۴-۱۵۸۵٫
Collis CM and Hall RM (1995). Expression of antibiotic resistance genes in the integrated cassettes of integrons. Antimicrob Agents Chemother. ۳۹: ۱۵۵-۱۶۲٫
Collis CM, Kim M-J, Partridge SR, Stokes H and Hall RM (2002a). Characterization of the class 3 integron and the site-specific recombination system it determines. J Bacteriol. ۱۸۴:۳۰۱۷-۳۰۲۶٫
Collis CM, Kim MJ, Stokes H and Hall RM (2002b). Integron‐encoded IntI integrases preferentially recognize the adjacent cognate attI site in recombination with a 59‐be site. Mol Microbiol. ۴۶: ۱۴۱۵-۱۴۲۷٫
Connell SR, Tracz DM, Nierhaus KH and Taylor DE (2003). Ribosomal protection proteins and their mechanism of tetracycline resistance. Antimicrob Agents Chemother. ۴۷: ۳۶۷۵-۳۶۸۱٫
Council NR (1999). Food- Animal Production Practices and Drug Use. The Use of Drugs in Food Animals: Benefits and Risks: 27- 69.
Cromwell G (1991). Antimicrobial agents. Swine nutrition: 297-314.
Cui L, Ma X, Sato K, Okuma K, Tenover FC, Mamizuka EM, Gemmell CG, Kim M-N, Ploy M-C and El Solh N (2003). Cell wall thickening is a common feature of vancomycin resistance in Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. ۴۱: ۵-۱۴٫
Cunha T, Meadows G, Edwards H, Sewell R, Shawver C, Pearson A and Glasscock R (1950). Effect of aureomycin and other antibiotics on the pig. J Anim Sci. ۹: ۶۵۳٫
CVP (2006). North America Compendiums. Port Huron, MI.
da Costa PM, Oliveira M, Bica A, Vaz-Pires P and Bernardo F (2007). Antimicrobial resistance in Enterococcus spp. and Escherichia coli isolated from poultry feed and feed ingredients. Vet Microbiol. ۱۲۰: ۱۲۲-۱۳۱٫
Davies J (1990). What are antibiotics? Archaic functions for modern activities. Mol Microbiol. ۴: ۱۲۲۷-۱۲۳۲٫
Davies J (2007). Microbes have the last word. A drastic re-evaluation of antimicrobial treatment is needed to overcome the threat of antibiotic-resistant bacteria. EMBO Rep. ۸: ۶۱۶
Davies J and Davies D (2010). Origins and Evolution of Antibiotic Resistance. Microbiol Mol Biol Rev: 417-433.
Davies JE (1997). Origins, acquisition and dissemination of antibiotic resistance determinants. Antibiotic resistance: origins, evolution, selection and spread: 15-35.
Ebner PD and Mathew AG (2000). Effects of antibiotic regimens on the fecal shedding patterns of pigs infected with Salmonella Typhimurium. Journal of Food Protection®. ۶۳: ۷۰۹-۷۱۴٫
Eisenberg E, Mandel L, Kaback H and Miller M (1984). Quantitative association between electrical potential across the cytoplasmic membrane and early gentamicin uptake and killing in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. ۱۵۷: ۸۶۳-۸۶۷٫
Endtz HP, Ruijs GJ, van Klingeren B, Jansen WH, van der Reyden T and Mouton RP (1991). Quinolone resistance in Campylobacter isolated from man and poultry following the introduction of fluoroquinolones in veterinary medicine. J Antimicrob Chemother. ۲۷: ۱۹۹-۲۰۸٫
Esposito D and Scocca JJ (1997). The integrase family of tyrosine recombinases: evolution of a conserved active site domain. Nucleic Acids Res. ۲۵: ۳۶۰۵-۳۶۱۴٫
FDA (2005). Document No. 2000N-1571 Withdrawal of the new animal drug application for enrofoxacin in poultry. [Online].
Fluit A and Schmitz FJ (2004). Resistance integrons and super-integrons. Clin Microbiol Infect. ۱۰: ۲۷۲-۲۸۸٫
Furtula V, Farrell E, Diarrassouba F, Rempel H, Pritchard J and Diarra M (2010). Veterinary pharmaceuticals and antibiotic resistance of Escherichia coli isolates in poultry litter from commercial farms and controlled feeding trials. Poult Sci. ۸۹: ۱۸۰-۱۸۸٫
Gillings MR, Xuejun D, Hardwick SA, Holley MP and Stokes H (2008). Gene cassettes encoding resistance to quaternary ammonium compounds: a role in the origin of clinical class 1 integrons? The ISME journal. ۳: ۲۰۹-۲۱۵٫
Goldstein C, Lee MD, Sanchez S, Hudson C, Phillips B, Register B, Grady M, Liebert C, Summers AO and White DG (2001). Incidence of class 1 and 2 integrases in clinical and commensal bacteria from livestock, companion animals, and exotics. Antimicrob Agents Chemother. ۴۵: ۷۲۳-۷۲۶٫
Gravel A, Fournier B and Roy PH (1998). DNA complexes obtained with the integron integrase IntI1 at the attI1 site. Nucleic Acids Res. ۲۶: ۴۳۴۷-۴۳۵۵٫
Greenwood D (1995). Antimicrobial Chemotherapy. Oxford University Press, New York.
Guardabassi L and Courvalin P (2006). Modes of antimicrobial action and mechanisms of bacterial
فرم در حال بارگذاری ...
|
[یکشنبه 1400-08-02] [ 07:04:00 ب.ظ ]
|
